發(fā)布時(shí)間：2018-11-19 07:59

【摘要】：目的 生物膜是微生物在自然狀態(tài)下的生存方式,其最重要的特征是生物膜微生物具有很強(qiáng)的耐藥性。作為人類最常見的條件致病真菌,白念珠菌(Candida albicans)在粘膜組織和植入性醫(yī)療器械表面形成生物膜,對多種抗真菌藥物高度耐受。Lewis等研究指出,白念珠菌生物膜中存在一小部分表現(xiàn)型耐藥菌株,在一定范圍內(nèi)提高藥物濃度或延長藥物作用時(shí)間也不能將其殺滅,這部分菌株被稱為滯留菌(persisters)。由于這種耐藥性不具有遺傳性,因此滯留菌并不是傳統(tǒng)意義上的耐藥菌株。Lewis認(rèn)為滯留菌的存在可能是生物膜具有耐藥性的真正原因,并且與臨床上常見的慢性反復(fù)性感染有密切關(guān)系。研究滯留菌在慢性頑固性感染中的作用和對抗菌治療效果的影響,具有重要的臨床意義。 秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)是常見的模式生物,用其建立白念珠菌感染模型可進(jìn)行抗真菌治療的研究。白念珠菌感染線蟲后,產(chǎn)生菌絲,形成生物膜,可導(dǎo)致線蟲的死亡。在前期研究工作中,本課題組從52名接受化療的惡性腫瘤病人口腔中獲得了131株白念珠菌臨床株,用100ug/ml的兩性霉素B沖擊其在96孔板中生長24小時(shí)形成的生物膜,篩選出了產(chǎn)生滯留菌比例為0.2%～9%的臨床株。這些臨床株均為非耐藥株,對兩性霉素B的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)差別不大。本實(shí)驗(yàn)用秀麗隱桿線蟲感染產(chǎn)生不同滯留菌比例的白念珠菌臨床株并用兩性霉素B處理,觀察比較線蟲的存活率來探討滯留菌的耐藥性對抗真菌治療效果的影響。 材料和方法 菌株和線蟲：產(chǎn)生高比例滯留菌的白念珠菌臨床株6株(滯留菌產(chǎn)生比例在8-9%)；產(chǎn)生低比例滯留菌白念珠菌臨床株6株(滯留菌產(chǎn)生比例均低于0.3%)；白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株3153a(滯留菌產(chǎn)生比例約為1%)。線蟲采用AU37glp-4(bn2)I; sek-1(km4)突變株。 抗真菌藥物：兩性霉素B 線蟲的同步化培養(yǎng)：線蟲于15℃培養(yǎng)5-6天至懷孕后,用M9緩沖液沖下,加入裂解液,震蕩裂解收集線蟲卵,在M9緩沖液中孵化24h,得到L1期幼蟲,將幼蟲轉(zhuǎn)移到NGM培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)3天,得到同步化的L4期成蟲。 白念珠菌線蟲感染模型的建立：將同步化的L4期線蟲分別轉(zhuǎn)移到含有白念珠菌各菌株菌苔的BHI培養(yǎng)基上,25℃共培養(yǎng)2小時(shí)(預(yù)留作為空白對照的不染菌線蟲)。用M9緩沖液洗脫蟲體,離心清洗3遍并制成線蟲懸浮液。按照高比例滯留菌組6組,低比例滯留菌組6組,標(biāo)準(zhǔn)株組和不染菌空白組的順序,96孔板中每孔加入含15～20條線蟲的M9懸浮液20μl后,再加入用40%BHI液體培養(yǎng)基+60%M9緩沖液二倍梯度稀釋的兩性霉素B130μl,使每組藥物濃度梯度為0.5,1.0,2.0,4.0,8.0,16.0μg/ml,并設(shè)立不加藥孔對照。每種處理均設(shè)三孔平行對照。將96孔板于25℃培養(yǎng)5天后觀察計(jì)算各孔線蟲存活率。 結(jié)果 各染菌組不加藥線蟲存活率相差較小,組內(nèi)加藥孔線蟲存活率較不加藥線蟲均有提高。隨著藥物濃度的增加,線蟲死亡率呈U型趨勢,藥物濃度為2-4μg/ml時(shí)各組內(nèi)加藥線蟲較不加藥線蟲的存活率的提升達(dá)到最高。相同藥物濃度下,高比例組線蟲較同組不加藥線蟲存活率的提高量明顯低于感染低比例組的提高量,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。兩性霉素B治療感染產(chǎn)生高比例滯留菌臨床株的線蟲效果不明顯,產(chǎn)生高比例滯留菌的白念珠菌臨床株在體內(nèi)更難以被抗真菌藥物殺滅。 結(jié)論 秀麗隱桿線蟲-念珠菌滯留菌模型為今后篩選抗滯留菌的藥物提供了藥效學(xué)評價(jià)模型；致病菌株產(chǎn)生滯留菌的能力具有重要的臨床意義,即滯留菌耐藥性可能是抗菌治療失敗和復(fù)發(fā)性感染的重要原因；對慢性真菌感染來說,檢測臨床菌株產(chǎn)生滯留菌的能力,可能會成為一種常規(guī)檢測手段,成為預(yù)測慢性感染性疾病的預(yù)后和治療困難程度的一個(gè)重要指標(biāo)。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R379

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號：2341626