【摘要】：目的:建立誘導型衰老細胞模型并檢測抗衰老相關的Klotho基因啟動子的不同截短型突變體的活性,為下一步研究奠定基礎.方法:原代的人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)經(jīng)過流式細胞術分離鑒定后,通過設置不同過氧化氫的濃度,按時間梯度摸索誘導原代HUVEC細胞衰老的條件并最終通過SA-β-gal染色及定量PCR技術來確定其誘導條件.以全長的Klotho啟動子為模版,通過PCR的方法,獲得不同長度的Klotho啟動子截短型突變體,并通過雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)檢測試劑盒檢測不同的啟動子截短型突變體在誘導型衰老細胞內(nèi)的激活程度.結(jié)果:培養(yǎng)基中過氧化氫濃度為600μM,處理96 h后,成功構(gòu)建了誘導型衰老細胞模型;通過PCR的方法成功構(gòu)建了長度分別為1 711 bp、1 262 bp、785 bp和735 bp的4個長度截短型突變體,并發(fā)現(xiàn)735 bp的截短型突變體在誘導型衰老細胞內(nèi)的激活程度存在明顯差異.結(jié)論:成功建立了誘導型衰老細胞模型,并成功構(gòu)建了Klotho基因的啟動子截短型突變體,檢測和發(fā)現(xiàn)這些突變子在誘導型衰老細胞內(nèi)的激活程度存在明顯差異,為下一步治療衰老相關疾病奠定了良好的工作基礎.
[Abstract]:Aim: to establish an induced senescence cell model and to detect the activity of different truncated mutants of anti-aging related Klotho gene promoters in order to lay a foundation for further research. Methods: the primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were isolated and identified by flow cytometry. The conditions for inducing senescence of primary HUVEC cells were explored according to the time gradient, and the inducing conditions were determined by SA- 尾-gal staining and quantitative PCR technique. Using the full-length Klotho promoter as template, the truncated mutants of Klotho promoter with different lengths were obtained by PCR. The activation degree of different truncated promoter mutants in induction senescence cells was detected by double luciferase reporter gene system. Results: the induced senescence cell model was successfully established after 96 h treatment with the concentration of hydrogen peroxide 600 渭 m in the medium. Four truncated mutants with the lengths of 1 711 bp,1 262 bp,785 bp and 735 bp were successfully constructed by PCR, and the activation of 735 bp truncated mutants in induced senescence cells was found to be significantly different. Conclusion: the induced senescence cell model was successfully established, and the truncated mutants of Klotho gene promoter were successfully constructed. For the next step in the treatment of aging related diseases laid a good foundation for the work.
【作者單位】： 暨南大學生物醫(yī)藥研究院暨南大學細胞生物學系基因工程藥物國家工程研究中心廣東省生物工程藥物重點實驗室廣東省生物技術藥物工程技術研究中心;
【基金】：國家自然科學基金項目(8147313) 廣州市科技計劃項目(2016201604030039)
【分類號】：R339.38

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