【摘要】：弓形蟲是一種細胞內(nèi)寄生的原蟲,可感染包括人在內(nèi)所有溫血脊椎動物的有核細胞,引起人獸共患弓形蟲病,嚴重威脅著人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)。目前為止,尚無有效的治療藥物。鑒于疫苗防治多種疾病的經(jīng)驗,研制安全有效的抗弓形蟲疫苗不失為一種具有潛力的防治措施。為此,本研究制備了弓形蟲致密顆粒抗原GRA7的DNA疫苗和蛋白疫苗,將其接種于BALB/c小鼠,評價疫苗的免疫效果,并觀察異質(zhì)性prime-boost免疫策略對小鼠免疫應(yīng)答的影響,為研制安全有效的弓形蟲疫苗及優(yōu)化免疫方案奠定基礎(chǔ)。 目的：構(gòu)建編碼弓形蟲致密顆粒抗原GRA7的真核表達質(zhì)粒pEGFP-GRA7和原核表達質(zhì)粒pET30-GRA7,分別制備弓形蟲GRA7的DNA疫苗和蛋白質(zhì)疫苗,評價疫苗的免疫效果,觀察prime-boost免疫策略對小鼠免疫應(yīng)答的影響。 方法：采用PCR技術(shù)從弓形蟲基因組DNA中擴增弓形蟲致密顆粒抗原GRA7基因,回收PCR產(chǎn)物,將其連接至克隆載體pEASY-T1中,構(gòu)建克隆載體pEASY-GRA7,分別進行菌落PCR、酶切和測序鑒定。采用亞克隆技術(shù)將GRA7基因分別克隆至真核表達載體pEGFP-C1和原核表達載體pET-30a(+)中,分別構(gòu)建能表達GRA7的重組真核表達載體pEGFP-GRA7和重組原核表達載體pET30-GRA7,并對它們進行鑒定。將pEGFP-GRA7轉(zhuǎn)染HFF細胞,經(jīng)熒光顯微鏡觀察、SDS-PAGE和Western blotting分析、鑒定后,大量提取重組質(zhì)粒pEGFP-GRA7用于制備弓形蟲GRA7DNA疫苗。將pET30-GRA7轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo),采用鎳柱親和層析法純化GRA7蛋白,SDS-PAGE和VWestern blotting分析鑒定后,制備弓形蟲GRA7重組蛋白疫苗。動物實驗觀察疫苗的免疫效果,同時評價異質(zhì)性prime-boost免疫策略對BALB/c小鼠免疫應(yīng)答的影響。結(jié)果：經(jīng)PCR體外擴增獲得GRA7基因片段,大小為708bp。重組真核表達質(zhì)粒pEGFP-GRA7經(jīng)菌落PCR、雙酶切鑒定,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在708bp處有一特異性條帶,與預(yù)期GRA7目的基因片段大小一致；DNA測序結(jié)果顯示目的基因片段GRA7準確插入真核表達質(zhì)粒中。pEGFP-GRA7轉(zhuǎn)染的HFF細胞經(jīng)熒光顯微鏡觀察、SDS-PAGE和Western blotting分析,均能檢測到GRA7蛋白的表達。重組原核表達質(zhì)粒pET30-GRA7經(jīng)菌落PCR、雙酶切鑒定,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在708bp處有一特異性條帶,與預(yù)期GRA7目的基因片段大小一致；DNA測序結(jié)果顯示目的基因片段GRA7準確插入原核表達質(zhì)粒中。pET30-GRA7轉(zhuǎn)入E.coli BL21誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting分析,可檢測到GRA7蛋白的表達。采用異質(zhì)性prime-boost免疫策略接種BALB/c小鼠,其中DNA疫苗初免-蛋白加強免疫組小鼠抗弓形蟲IgG、IgG2a和IFN-γ水平均高于其它實驗組(P0.05),而各組間IL-4和IL-10水平差異無顯著性。 結(jié)論：體外擴增弓形蟲致密顆�？乖璆RA7基因并亞克隆到表達載體中,成功制備了弓形蟲GRA7的DNA疫苗和蛋白疫苗。采用DNA疫苗初免-蛋白加強免疫策略可誘導(dǎo)小鼠較強的抗GRA7的體液免疫和細胞免疫,顯著增強小鼠抗弓形蟲感染的保護作用。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2340173