【摘要】：血吸蟲(chóng)病是由血吸蟲(chóng)感染引起的一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的寄生病,我國(guó)流行的主要是日本血吸蟲(chóng)病。截至目前,臨床上還沒(méi)有有效的預(yù)防血吸蟲(chóng)病的疫苗,治療藥物也僅限于吡喹酮1種,而且已經(jīng)使用了近40年。長(zhǎng)期的單一用藥難免會(huì)誘導(dǎo)抗藥性蟲(chóng)株的出現(xiàn),因此亟待開(kāi)發(fā)新的抗蟲(chóng)疫苗或藥物用于血吸蟲(chóng)病的防治。疫苗或藥物的開(kāi)發(fā)依賴(lài)于對(duì)血吸蟲(chóng)自身代謝途徑及其與宿主相互作用機(jī)制的深入了解。近年來(lái),血吸蟲(chóng)氧化還原代謝途徑或氧化還原相關(guān)蛋白日益引起人們的重視,這是因?yàn)檠趸�原過(guò)程對(duì)于蟲(chóng)體自身的能量供給、基因調(diào)控、細(xì)胞生長(zhǎng)分化以及幫助蟲(chóng)體有效的逃避宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的活性氧侵害等具有十分重要的意義。本研究選定了3個(gè)日本血吸蟲(chóng)氧化還原相關(guān)蛋白,并對(duì)其功能、結(jié)構(gòu)和應(yīng)用進(jìn)行了深入探討。在日本血吸蟲(chóng)醛糖還原酶(SjAR)的研究中,克隆、表達(dá)和純化了重組的SjAR蛋白,建立了其體外酶活測(cè)定方法。以SjAR為藥物靶點(diǎn)的研究中,首先解析了SjAR的三級(jí)結(jié)構(gòu),隨后應(yīng)用分子對(duì)接技術(shù)從Maybridge化合物庫(kù)中篩選出10種小分子用于體外殺蟲(chóng)活性測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其中1種化合物AR9具有很好的殺蟲(chóng)活性,半數(shù)致死劑量LD50值為(5.48±2.38)μg/ml;進(jìn)一步靶點(diǎn)確認(rèn)證實(shí)它能夠抑制重組SjAR的活性,其半數(shù)抑制濃度IC50值約為11.75 μg/ml;細(xì)胞毒性測(cè)試顯示該化合物對(duì)宿主細(xì)胞的毒性較小,提示其可作為治療血吸蟲(chóng)病的先導(dǎo)化合物,指導(dǎo)后續(xù)抗蟲(chóng)新藥的開(kāi)發(fā)。此外,本研究也評(píng)估了SjAR作為抗血吸蟲(chóng)疫苗的潛質(zhì),結(jié)果顯示重組SjAR蛋白免疫后的小鼠較佐劑組相比,成蟲(chóng)數(shù)減少了32.9%(P0.01),肝臟和糞便中蟲(chóng)卵數(shù)也相應(yīng)減少28.3%(P0.05)和42.8%(P0.05),提示SjAR具備成為血吸蟲(chóng)候選疫苗的潛質(zhì),值得深入研究。功能研究方面,轉(zhuǎn)錄水平上雄蟲(chóng)SjAR的水平要明顯高于雌蟲(chóng),進(jìn)一步的組織定位顯示SjAR在雄蟲(chóng)的抱雌溝處豐度較高,說(shuō)明SjAR很可能是一種性別差異表達(dá)蛋白。在日本血吸蟲(chóng)3-氧化�；�-�；d體蟹白還原酶(SjOAR)的研究中,克隆、表達(dá)、純化了重組的SjOAR蛋白,建立了體外酶活的測(cè)定方法,測(cè)定了其動(dòng)力學(xué)參數(shù),并進(jìn)一步證實(shí)其酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)為序列機(jī)制。在以SjOAR為藥物靶點(diǎn)的研究中,首先用同源模建的方法構(gòu)建了SjOAR的三維結(jié)構(gòu),隨后同樣使用分子對(duì)接技術(shù)從Maybridge化合物庫(kù)中篩選出27種小分子用于后續(xù)的BIAcore分析和體外殺蟲(chóng)活性測(cè)試。BIAcore分析結(jié)果顯示27種化合物均能夠與SjOAR發(fā)生不同程度結(jié)合,部分化合物的解離常數(shù)KD可達(dá)10 μM,結(jié)合能力最好的OAR27可達(dá)1.85×10μM。體外殺蟲(chóng)活性測(cè)試結(jié)果顯示OAR19、OAR22和OAR273種化合物具有明顯的殺蟲(chóng)效果,其半數(shù)致死劑量LDso值分別為(19.7±8.7)μg/ml, (18.0±7.6)μg/ml和(18.5±6.1)μg/ml。為了證實(shí)這3種化合物確實(shí)以SjOAR為靶點(diǎn),本研究又測(cè)試了它們對(duì)重組SjOAR活性的抑制,結(jié)果顯示OAR22和OAR27均能夠在不同程度上抑制SjOAR的活性[IC50值分別為80μg/ml和(21.79±1.33)μg/ml],而OAR19則不能抑制SjOAR的活性。說(shuō)明OAR19的作用靶位并不是SjOAR,而OAR22和OAR27則可能通過(guò)抑制SjOAR的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)其干擾蟲(chóng)體生命活動(dòng)以致殺蟲(chóng)的目的。細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果顯示,OAR19細(xì)胞毒性較大,OAR27次之,OAR22最小。此外,鑒于SjOAR具有很好的免疫原性,本研究也評(píng)估了重組SjOAR作為抗蟲(chóng)疫苗的價(jià)值,結(jié)果顯示SjOAR能夠誘導(dǎo)感染日本血吸蟲(chóng)的小鼠產(chǎn)生部分減蟲(chóng)率和減卵率,但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫熒光定位結(jié)果顯示,SjOAR主要位于蟲(chóng)體的內(nèi)部,且豐度較高。在日本血吸蟲(chóng)硫氧還蛋白-1 (SjTrx-1)的研究中,克隆、表達(dá)和純化了SjTrx-1重組蛋白,并測(cè)定了其體外的酶催化活性。以SjTrx-1作為藥物靶點(diǎn)的研究中,發(fā)現(xiàn)之前報(bào)道的硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶(TGR)的抑制劑金諾芬同樣能夠抑制SjTrx-1的活性,說(shuō)明血吸蟲(chóng)中TGR并不是金諾芬作用的唯一靶點(diǎn)。金諾芬殺蟲(chóng)活性測(cè)試結(jié)果顯示,它具有非常好的體外殺蟲(chóng)效果,而且其對(duì)成蟲(chóng)的效果要好于童蟲(chóng)。細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果顯示金諾芬在殺蟲(chóng)濃度下(5 μg/ml)具有顯著的細(xì)胞毒性,這與以往研究顯示細(xì)胞能在100μM的金諾芬(約68 μg/ml)濃度下存活5天的結(jié)果不一致,本研究對(duì)上述結(jié)果提出質(zhì)疑。免疫熒光定位結(jié)果顯示,SjTrx-1在蟲(chóng)體內(nèi)的分布比較廣泛,且豐度較高。綜上,本研究綜合運(yùn)用生物信息學(xué)、分子生物學(xué)、蛋白酶學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)以及免疫學(xué)等多種方法,對(duì)日本血吸蟲(chóng)3種氧化還原相關(guān)蛋白的功能、結(jié)構(gòu)和應(yīng)用研究進(jìn)行了深入探討,研究結(jié)果對(duì)血吸蟲(chóng)病的預(yù)防和治療有一定的借鑒意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R383.24

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 杜健;李晶;房修羅;景志敏;;日本血吸蟲(chóng)rSj26GST疫苗抑制小鼠肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫形成的效果觀察[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2010年11期

2 尤紀(jì)青，郭惠芳，梅靜艷，，焦佩英，馮建軍，姚民一，肖樹(shù)華;蒿甲醚對(duì)日本血吸蟲(chóng)糖原、蛋白質(zhì)、鹼性磷酸酶和酸性磷酸酶的影響[J];中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志;1994年04期

本文編號(hào)：2336069