【摘要】：本實驗構(gòu)建針對大鼠的Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合物反式轉(zhuǎn)錄激活因子(classⅡ major histocompability complex transactivator,CⅡTA)和髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)基因的短發(fā)夾狀 RNA(small hairpin RNA,shRNA)質(zhì)粒和納米陽離子高分子脂質(zhì)體;應(yīng)用兩者偶合形成納米載體于體外轉(zhuǎn)染大鼠骨髓源樹突狀細胞(dendritic cell,DC),觀察其介導(dǎo)RNA干擾對CⅡTA和MHC-Ⅱ以及MyD88基因表達的抑制,并篩選相對高效的載shRNA納米載體;評價其介導(dǎo)RNA干擾目的基因沉默干預(yù)免疫識別的效果;研究納米載體介導(dǎo)RNA干擾CⅡTA和MyD88干預(yù)免疫識別在控制移植免疫排斥反應(yīng)中的作用和探討其機制。一、納米載體的構(gòu)建及體外轉(zhuǎn)染實驗?zāi)康?構(gòu)建載shRNA質(zhì)粒和納米陽離子高分子脂質(zhì)體并偶合為納米載體,觀察其體外轉(zhuǎn)染HCT-116細胞的轉(zhuǎn)染效率,確定實驗轉(zhuǎn)染方案。方法:構(gòu)建針對大鼠CⅡTA和MyD88基因載shRNA質(zhì)粒和納米陽離子高分子脂質(zhì)體;對納米陽離子高分子脂質(zhì)體進行表征;應(yīng)用體外培養(yǎng)HCT-116細胞,經(jīng)MTT法驗證納米陽離子高分子脂質(zhì)體的生物安全性;通過載shRNA質(zhì)粒與納米陽離子高分子脂質(zhì)體偶合實驗,確定兩者最佳結(jié)合比;應(yīng)用載shRNA質(zhì)粒與納米陽離子高分子脂質(zhì)體偶合形成納米載體,分別設(shè)置空白對照組、Lipofectamine組、單純質(zhì)粒組和以不同質(zhì)量比載shRNA質(zhì)粒與納米陽離子高分子脂質(zhì)體偶合形成的納米載體組(兩者質(zhì)量比分別為1:0.5,1:1,1:2,1:3和1:4),于體外轉(zhuǎn)染HCT-116細胞,采用倒置熒光顯微鏡觀察和流式細胞術(shù)(FCM)觀察轉(zhuǎn)染效果,比較轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果:載shRNA質(zhì)粒和納米陽離子高分子脂質(zhì)體構(gòu)建成功;納米陽離子高分子脂質(zhì)體理化性能穩(wěn)定、安全低毒(IC50=7.605×10-2g/L)且免疫原性低,跨膜能力強,可用于構(gòu)建載shRNA納米載體;載shRNA質(zhì)粒和納米陽離子高分子脂質(zhì)體偶合形成納米載體的最佳結(jié)合質(zhì)量比為1:2;在載shRNA質(zhì)粒和納米陽離子高分子脂質(zhì)體以最佳結(jié)合比偶合形成納米載體時,其轉(zhuǎn)染HCT-116細胞的轉(zhuǎn)染效率最高(28.19±5.38%),且優(yōu)于轉(zhuǎn)染劑Lipofectamine組(P0.01)。結(jié)論:納米陽離子高分子脂質(zhì)體制備簡便、安全低毒,免疫原性低;其與載shRNA質(zhì)粒于最佳結(jié)合比偶合成功構(gòu)建納米載體轉(zhuǎn)染HCT-116細胞,具有高效和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效率,可用于介導(dǎo)RNA干擾抑制免疫識別相關(guān)基因CⅡTA和MyD88表達的研究。二、納米載體介導(dǎo)沉默免疫識別相關(guān)基因表達的研究目的:觀察納米載體介導(dǎo)RNA干擾對免疫識別相關(guān)基因CⅡTA和MyD88表達的抑制效果以及CⅡTA基因?qū)τ贛HC-Ⅱ基因表達的調(diào)控作用。方法:體外培養(yǎng)大鼠骨髓源DC;應(yīng)用針對大鼠CⅡTA和MyD88基因的各三個納米載體,分別設(shè)置空白對照組、單純納米組、pHK-納米載體陰性對照組和三個pCⅡTA-納米載體干預(yù)組或三個pMyD88-納米載體干預(yù)組,分別轉(zhuǎn)染DC,以熒光實時定量 PCR、FCM 和 Western blot 檢測 DC 轉(zhuǎn)染后 CⅡTA 和 MHC-Ⅱ 及 MyD88 的表達變化。結(jié)果:大鼠骨髓源DC培養(yǎng)成功;與空白對照組、單純納米組、pHK-納米載體陰性對照組相比,三個pC Ⅱ TA-納米載體干預(yù)組DC轉(zhuǎn)染后CⅡ TA和MHC-Ⅱ mRNA轉(zhuǎn)錄水平及MHC-Ⅱ蛋白表達水平均顯著性減低(P0.01),CⅡTA與MHC-Ⅱ基因表達呈高度正相關(guān);pC ⅡTA 2-納米載體干預(yù)組對CⅡTA與MHC-Ⅱ基因表達的抑制更為明顯,CⅡTA mRNA轉(zhuǎn)錄水平為0.12±0.04,MHC-Ⅱ mRNA 轉(zhuǎn)錄水平為 0.10±0.04,MHC-Ⅱ 蛋白表達水平為 22.08±3.07%;三個pMyD88-納米載體干預(yù)組DC轉(zhuǎn)染后MyD88 mRNA轉(zhuǎn)錄水平及MyD88蛋白表達水平均顯著性減低(P0.01),MyD88的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達水平呈高度正相關(guān);pMyD88 1-納米載體干預(yù)組對目的基因表達抑制更為明顯,MyD88的mRNA轉(zhuǎn)錄水平為0.11±0.04,MyD88蛋白表達水平為0.11±0.05。結(jié)論:應(yīng)用成功構(gòu)建pC ⅡTA-納米載體轉(zhuǎn)染大鼠骨髓源DC,可顯著抑制DC的CⅡTA和MHC-Ⅱ基因表達;CⅡTA與MHC-Ⅱ的基因表達具有高度正相關(guān),提示CⅡTA嚴格調(diào)控MHC-Ⅱ表達,納米載體介導(dǎo)RNA干擾CⅡTA可明顯抑制MHC-Ⅱ基因表達;應(yīng)用成功構(gòu)建pMyD88-納米載體轉(zhuǎn)染大鼠骨髓源DC,可顯著抑制DC的MyD88基因表達;pCⅡTA 2-納米載體和pMyD88 1-納米載體介導(dǎo)RNA干擾相對高效,兩者可進一步應(yīng)用于評價納米載體介導(dǎo)干預(yù)免疫識別的實驗研究。三、納米載體介導(dǎo)干預(yù)免疫識別作用的研究目的:評價PCⅡTA 2-納米載體和pMyD88 1-納米載體介導(dǎo)RNA干擾干預(yù)免疫識別的效應(yīng),探討免疫識別相關(guān)基因沉默影響免疫識別的作用機制。方法:分別應(yīng)用pCⅡTA 2-納米載體和pMyD88 1-納米載體轉(zhuǎn)染大鼠DC;設(shè)置陽性對照組、單純納米組、陰性HK納米載體組、CⅡTA或MyD88沉默干預(yù)組和陰性對照組;與異系大鼠脾淋巴細胞進行混合淋巴細胞培養(yǎng),分別經(jīng)MTT法和流式細胞術(shù)觀察CⅡTA沉默干預(yù)DC對淋巴細胞增殖狀態(tài)及T細胞表型的影響,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測白介素-2(IL-2)、γ-干擾素(IFN-γ)的含量。通過脂多糖刺激實驗,應(yīng)用熒光實時定量PCR和Western Blot檢測LPS刺激后MyD88沉默干預(yù)DC MyD88表達水平,分別采用ELISA及FCM,檢測LPS刺激后MyD88沉默干預(yù)DCIL-2和IFN-y分泌水平,以及MHC-Ⅱ蛋白抗原表達。結(jié)果:混合淋巴細胞培養(yǎng)后,與陽性對照組、單純納米組和陰性HK納米載體組比較,CⅡTA沉默干預(yù)組淋巴細胞增殖刺激指數(shù)明顯降低(1.15±0.14,P0.01),上清液中細胞因子INF-y和IL-2含量顯著減少(INF-γ42.39±7.68 pg/mL,IL-2 67.83±18.35pg/mL;P0.01),CD4 陽性細胞百分比減低(48.38±8.63%,P0.01)和 CD4+/CD8+比值下降(1.89±0.26,P0.01),而 CD8 陽性細胞百分比的差異未見顯著性(P0.05);經(jīng)脂多糖刺激后,與陽性對照組、單純納米組和陰性HK納米載體組比較,MyD88沉默干預(yù)組DC的MyD88 m RNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達明顯降低(0.22±0.08,0.16±0.04;P0.01),其分泌細胞因子 INF-y 和 IL-2 分泌水平顯著下降(32.49±5.65pg/mL,21.08±4.13pg/mL;P0.01),MHC-Ⅱ蛋白抗原的表達也明顯減少(45.21±5.09%,P0.01)。結(jié)論:納米載體介導(dǎo)CⅡTA和MyD88基因沉默有效地抑制了免疫識別過程,減輕了免疫應(yīng)答。其機制為免疫原性降低及免疫識別信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻斷,抑制了 T細胞增殖與活化及抗原呈遞細胞自身的分化成熟,導(dǎo)致針對外來抗原刺激的免疫識別顯著減低,從而有效減輕免疫反應(yīng)強度,有利于更好地抑制移植排斥反應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

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本文編號：2335199