【摘要】：志賀毒素(Shiga toxin, Stx)是腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic E. coli, EHEC)O157:H7及其他腸出血性大腸桿菌所產(chǎn)生的蛋白毒素中的一員,是產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxin producing E. coli, STEC)的主要毒力因子。Stx作為一種毒性極強的菌外毒素,小鼠LDso僅為1ng,其毒性分別是有機磷神經(jīng)毒劑VX和沙林的7,000倍和45,000倍,因此成為潛在的生物恐怖病原,受到各國政府和科學(xué)家的重視。Stx家族包括Stx1和Stx2,其中Stx2被認(rèn)為是感染性溶血性尿毒綜合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)的主要致病原,嚴(yán)重危害感染人群中的老人和兒童的生命安全。本論文針對毒性活性較強的Stx2作為研究對象,通過闡明Stx2在大鼠體內(nèi)的代謝規(guī)律及組織分布特征,為進一步明確Stx2的致病機理提供了新的試驗依據(jù),同時為今后Stx2相關(guān)性疾病防治藥物的篩選評價提供了相關(guān)技術(shù)和試驗?zāi)Ｐ汀?一、Stx2的制備及純化 Stx2蛋白的制備和純化是本研究的首先要解決的技術(shù)問題。已有多篇文獻報道克隆表達志賀毒素亞單位,而全毒素克隆表達報道很少,因為難以得到純度高、產(chǎn)量高、生物活性高的重組志賀毒素全毒素(rStx)。首先,Stx的兩個亞單位需要分別表達,然后組裝成AB5型結(jié)構(gòu)；其次,當(dāng)rStx表達后,需將其從眾多雜蛋白中分離純化出來,并且達到后期實驗要求的高濃度及純度。在前期工作中,課題組利用基因重組技術(shù),采用一種簡單的方法來構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-stx2,通過自動誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得高產(chǎn)帶有組氨酸標(biāo)簽的rStx2,然后,通過鎳柱純化帶組氨酸標(biāo)簽的rStx2。SDS-PAGE分析純化產(chǎn)物：Stx2A分子量約為32kDa, Stx2B分子量約為7.7kDa; Native-PAGE分析全毒素分子量約為70 kDa,與預(yù)期一致。經(jīng)多次優(yōu)化實驗條件后,我們獲得一批可應(yīng)用于后期實驗的rStx2,考馬斯亮藍(lán)法檢測其蛋白濃度可達1.2mg/ml; Bandscan5.0軟件分析蛋白純度達96.6%；毒性活性實驗結(jié)果表明：制備的rStx2具有HeLa細(xì)胞毒的CD50為0.5ng和小鼠LD50為2.3μg/kg,與天然志賀毒素的毒性活性相似。因此,本研究中的rStx可應(yīng)用于體內(nèi)外染毒模型的建立、藥物的篩選與評價等。 二、放射性125I標(biāo)記Stx2的方法學(xué)建立與活性鑒定 Stx2作為一種分子量為70kDa的大分子蛋白,它在體內(nèi)的代謝及轉(zhuǎn)化是十分復(fù)雜的,目前還沒有具體的檢測方法和評價標(biāo)準(zhǔn),常參考蛋白類藥物的實驗方法及檢測手段。放射性同位素作為示蹤劑不僅靈敏度高,測量方法簡便易行,還能準(zhǔn)確地定量定位,符合所研究對象的生理條件。在Stx的體內(nèi)外研究中,已有研究者們采用放射性125I標(biāo)記毒素蛋白檢測或跟蹤其在動物體內(nèi)的動態(tài)遷移。本研究中,我們使用半衰期為60天的放射性核素125I作為放射性示蹤劑,對Stx2進行標(biāo)記。經(jīng)過125I標(biāo)記純化后所獲得的125I_Stx2樣品,經(jīng)測定其標(biāo)記率為31.8%,放化比活為9.6kbq/ml,濃度為0.6 mg/ml,生物活性與標(biāo)記前沒有明顯改變,達到用于體內(nèi)外試驗對樣品的要求。為后期研究Stx2在機體內(nèi)的代謝及組織分布的工作建立一種可靠、靈敏的檢測手段,奠定了堅實的實驗基礎(chǔ)。 三、Stx2在動物體內(nèi)的代謝及組織分布 Stx2是一種致死性蛋白毒素,其相關(guān)性感染可引起系統(tǒng)性損傷,特別是出血性尿毒綜合癥(hemolytic uremic syndrome, HUS),對兒童的危害極大。目前,對于Stx2相關(guān)性感染尚無有效的治療方案。因此,了解Stx2在機體內(nèi)的代謝規(guī)律及組織分布特點有利于闡明Stx2尚不明確的致病機理,為治療Stx2相關(guān)性感染提供相關(guān)的實驗依據(jù)。在本論文中,我們采用經(jīng)典的放射性碘追蹤手段對Stx2在機體內(nèi)的動態(tài)進行了詳細(xì)的描述。尾靜脈輸注不同劑量(5.1-127.5μg/kg)的125I-Stx2于大鼠體內(nèi),通過γ-計數(shù)儀測定不同時間點血樣中及各組織中的cpm值,根據(jù)所得的cpm值明確Stx2在大鼠體內(nèi)的代謝動力學(xué)規(guī)律及組織分布特征。結(jié)果表明,Stx2在大鼠體內(nèi)的代謝符合劑量依賴型-非線性代謝動力學(xué)規(guī)律(dose-dependent and nonlinear toxicokinetics course), Stx2的快分布半衰期(tl/2a)短暫,均小于6min,而消除半衰期相對較長。當(dāng)Stx2的給予量為25.5μg/kg和127.5μg/kg時,其代謝動力學(xué)模型符合三室模型(three-compartment model),清除半衰期(t1/2 y)分別為27.8h和22h；當(dāng)Stx2的給予量為5.1μg/kg時,其代謝動力學(xué)模型符合二室模型(two-compartment model),清除半衰期(t1/2β)為2.6h。Stx2在大鼠體內(nèi)的組織分布主要集中在肺和腎臟,鼻甲骨中檢測到大量的放射值(cpm),有時也會在眼組織中檢測到高的cpm值,后者在目前的文獻中尚未有報道。除此之外,我們還檢測到Stx2造成大鼠腎臟和胸腺嚴(yán)重?fù)p傷,并觀察到Stx2使大鼠的盲腸發(fā)生明顯炎癥,胃潴留等現(xiàn)象�？傊�,我們通過對Stx2在大鼠體內(nèi)的研究,指出Stx2這種強毒性蛋白毒素在大鼠體內(nèi)的代謝符合劑量依賴型-非線性代謝動力學(xué)規(guī)律,其快分布半衰期極短,少于6min,提示在抗Stx2相關(guān)行感染的治療中應(yīng)檢測Stx2在血液中的水平,結(jié)合考慮Stx2在機體內(nèi)的快速分布期,盡早給予抗Stx2的藥物以阻斷Stx2與機體內(nèi)各靶組織的結(jié)合,減少Stx2對機體的傷害,為制定抗Stx2的有效治療方案提供可靠的實驗依據(jù)；此外,Stx2的組織分布及病理檢測的結(jié)果指出Stx2在眼組織中有分布,對胸腺、盲腸和胃產(chǎn)生明顯損傷,這些填補了Stx2尚未發(fā)現(xiàn)的組織分布和損傷,提示Stx2的相關(guān)性感染可能引起這些器官的損傷,應(yīng)在防治Stx2相關(guān)性感染的過程中對這些組織器官進行檢查并采取相應(yīng)的預(yù)防措施,減少Stx2引起的系統(tǒng)性損傷。 四、共聚焦顯微鏡(CLSM)及活體成像技術(shù)在Stx2體內(nèi)外示蹤檢測中的初步應(yīng)用 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,生物領(lǐng)域中的檢測方法不斷更新,基于后期試驗工作的需要,我們基于共聚焦顯微鏡(CLSM)及活體成像技術(shù),建立針對毒素蛋白的細(xì)胞水平和機體系統(tǒng)水平的示蹤檢測方法。在本章研究中,我們使用共聚焦顯微鏡成功地描述了Stx2進入HeLa細(xì)胞的動態(tài)過程：將Stx2與HeLa細(xì)胞孵育,0時間點時,Stx2主要分布在HeLa細(xì)胞的表面即細(xì)胞膜上；30min時,Stx2部分分布在細(xì)胞膜上,部分進入細(xì)胞內(nèi),在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核周圍均有分布；60min時,Stx2主要分布在細(xì)胞核周圍,熒光量明顯減少。本結(jié)果客觀地描述了Stx2通過與HeLa細(xì)胞膜的結(jié)合進入細(xì)胞內(nèi)部,到達細(xì)胞核的過程。發(fā)現(xiàn)Stx2與HeLa細(xì)胞孵育60min時,被細(xì)胞大量降解,表明HeLa細(xì)胞具有對Stx2降解的功能,且降解時間段主要在Stx2與HeLa細(xì)胞結(jié)合后的60min左右,同時這也可能是Stx2的A亞單位執(zhí)行其細(xì)胞毒性的時間段。此外,我們利用活體成像技術(shù)觀察Stx2在小鼠體內(nèi)的動態(tài)遷移,發(fā)現(xiàn)在小鼠肝部位的熒光隨著時間的延長而增強,i.v.后30min時熒光最強,隨后熒光減弱,推測Stx2于i.v.后的前30min內(nèi)主要流向肝臟；而在小鼠膀胱中的熒光于i.v.后30min逐漸增強,50min時最強,推測Stx2于i.v.后30min開始排泄。本部分研究,我們嘗試通過共聚焦顯微鏡和活體成像這兩種在國際上較為前沿的技術(shù),建立對Stx2體內(nèi)外的檢測方法,為后期的抗Stx藥物發(fā)展提供新的檢測分析手段。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：沈陽藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R378

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