【摘要】：目的: Proliferin related protein(PRP)最初被認(rèn)為是小鼠胎盤血管生成抑制因子,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道PRP僅表達(dá)于雌性胎盤組織。因此,盡管此基因發(fā)現(xiàn)至今已有20多年,但一直被排除在雄性之外,直接的實(shí)驗(yàn)研究?jī)H見(jiàn)于幾篇文獻(xiàn)報(bào)道。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)PRP表達(dá)于睪丸,因此本研究擬探索PRP在睪丸中的表達(dá)定位, PRP是否在雄性動(dòng)物表達(dá),及其在雄性生殖功能中的作用,PRP對(duì)人類腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 方法: 采用原位雜交和免疫組化方法對(duì)PRP進(jìn)行組織學(xué)定位, Real-Time RT-PCR方法研究PRP在大鼠睪丸表達(dá)水平與年齡的關(guān)系以及人參皂苷對(duì)PRP表達(dá)的影響。 利用BLOCK-iTTM HiPerform TM Lentiviral Pol II miR RNAi Expression System with EmGFP試劑盒制備和包裝PRP-RNAi慢病毒,以miRNA方式干擾PRP表達(dá)。用Real-Time RT-PCR方法檢測(cè)PRP沉默后對(duì)睪酮分泌相關(guān)基因的影響,及對(duì)HCG誘導(dǎo)睪酮分泌是否有影響,ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞睪酮產(chǎn)生情況。 構(gòu)建PRP基因熒光表達(dá)載體,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TM3細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)分析TM3細(xì)胞周期分布。為了研究PRP對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響,轉(zhuǎn)染SGC-7901腫瘤細(xì)胞,分析腫瘤細(xì)胞增殖改變和周期分布。 結(jié)果: 1免疫組化和原位雜交結(jié)果顯示PRP陽(yáng)性免疫染色位于睪丸間質(zhì)細(xì)胞。免疫熒光染色顯示PRP在TM3細(xì)胞胞漿中表達(dá)。 2 PRP在大鼠睪丸中的表達(dá)模式為隨年齡增加而增加。有趣的是,人參皂苷可以顯著下調(diào)老年大鼠睪丸PRP表達(dá)水平。HCG通過(guò)PKA途徑顯著上調(diào)TM3細(xì)胞中PRP表達(dá)水平。 3慢病毒介導(dǎo)PRP沉默減弱HCG刺激睪酮產(chǎn)生的作用。另外,PRP沉默后抑制HCG刺激PRLR mRNA增加的作用,且PRL促進(jìn)HCG誘導(dǎo)睪酮產(chǎn)生的作用也因?yàn)镻RP沉默而減弱,表明了PRP可能通過(guò)影響PRLR表達(dá)而參與到睪酮合成。 4對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的研究表明PRP可能對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用。 結(jié)論: 1我們首次發(fā)現(xiàn)PRP在睪丸間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。 2人參皂甙可以顯著下調(diào)老年大鼠睪丸PRP表達(dá)水平。 3 PRP基因沉默后減弱了HCG刺激睪酮產(chǎn)生的作用。 4 PRP對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖有抑制效應(yīng)。
[Abstract]:Objective: Proliferin related protein (PRP) was initially thought to be a mouse placental angiogenesis inhibitor. It was reported that PRP was expressed only in female placenta. Therefore, although the gene has been discovered for more than 20 years, it has been excluded from males. We found that PRP was expressed in testis by chance in previous experiments. Therefore, we intend to explore the expression of PRP in testis, whether PRP is expressed in male animals and its role in male reproductive function, and the effect of PRP on the growth of human tumor cells. Methods: the histological localization of PRP was performed by in situ hybridization and immunohistochemistry. The relationship between the expression of PRP in rat testis and age and the effect of ginsenoside on the expression of PRP were studied by Real-Time RT-PCR method. PRP-RNAi lentivirus was prepared and packaged by BLOCK-iTTM HiPerform TM Lentiviral Pol II miR RNAi Expression System with EmGFP kit and interfered with PRP expression by miRNA. Real-Time RT-PCR was used to detect the effect of PRP silencing on testosterone secretion related genes and whether HCG induced testosterone secretion. ELISA method was used to detect testosterone production in cells. The fluorescent expression vector of PRP gene was constructed, and the recombinant plasmid was transfected into TM3 cells. The cell cycle distribution of TM3 cells was analyzed by flow cytometry. In order to study the effect of PRP on the growth and proliferation of tumor cells, SGC-7901 tumor cells were transfected and the cell proliferation and cell cycle distribution were analyzed. Results: 1Immunohistochemistry and in situ hybridization showed that PRP positive immunostaining was located in interstitial cells of testis. Immunofluorescence staining showed that PRP was expressed in the cytoplasm of TM3 cells. 2 the expression pattern of PRP in testis of rats increased with age. Interestingly, ginsenoside could significantly down-regulate the expression of PRP in testis of aged rats. HCG significantly up-regulated the expression of PRP in TM3 cells through PKA pathway. Lentivirus mediated PRP silencing attenuates the effect of HCG stimulation on testosterone production. In addition, PRP silencing inhibits the increase of PRLR mRNA stimulated by HCG, and the effect of PRL on HCG induced testosterone production is weakened by PRP silencing, which suggests that PRP may participate in testosterone synthesis by affecting PRLR expression. 4 the study of cell growth and cell cycle showed that PRP may inhibit cell proliferation. Conclusion: 1 We found that PRP was expressed in Leydig cells of testis for the first time. 2 ginsenosides can significantly down-regulate the expression of PRP in the testis of aged rats. 3 PRP gene silencing attenuates the effect of HCG on testosterone production. 4 PRP could inhibit the proliferation of tumor cells.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R363

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