【摘要】：目的 在前期研究中發(fā)現(xiàn),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)可以誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞凋亡,但是其是否能夠誘導(dǎo)B16細(xì)胞發(fā)生自體吞噬目前尚不明確。因此,在前期研究的基礎(chǔ)上,通過相差顯微鏡觀察細(xì)胞活性、透射電子顯微鏡(TEM)觀察細(xì)胞內(nèi)是否存在自體吞噬泡及其數(shù)量的變化,分析TNF-a是否能夠誘導(dǎo)B16細(xì)胞發(fā)生自體吞噬；進(jìn)一步檢測自噬相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化,分析參與TNF-α誘導(dǎo)的B16細(xì)胞自體吞噬的關(guān)鍵因子；并通過檢測自噬信號通路上的標(biāo)志性基因和蛋白的表達(dá),分析TNF-α誘導(dǎo)B16細(xì)胞自噬的信號通路,以及各通路對自噬的調(diào)控作用。 方法 1.體外培養(yǎng)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞,根據(jù)處理方法不同分為對照組、TNF-α處理組(20ng/mlTNF-α處理12h、24h)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)+TNF-α處理組(lOmmol/L3-MA預(yù)處理2h,20ng/mlTNF-α處理12h、24h)。 2.相差顯微鏡觀察TNF-α處理前后B16細(xì)胞的生長狀態(tài)和細(xì)胞活性。 3.TEM觀察TNF-a處理前后B16細(xì)胞內(nèi)自體吞噬泡的變化。 4.收取細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測自噬相關(guān)基因Atg5、Atg7、Atg12及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵基因Chop mRNA的表達(dá)變化。 5.收取細(xì)胞,RIPA裂解液裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,蛋白免疫印跡(Western blot)方法檢測自噬標(biāo)志性蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)、自噬性死亡標(biāo)志性蛋白Beclinl、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路及磷酸肌醇3激酶(P13K)/蛋白激酶B(PKB,又稱Akt)通路關(guān)鍵蛋白核糖體S6蛋白激酶(p70S6K)及Akt磷酸化水平的變化。 結(jié)果 1.與對照組相比,TNF-α處理后的B16細(xì)胞出現(xiàn)明顯的生長抑制現(xiàn)象,可見部分細(xì)胞死亡,TNF-α處理12h后細(xì)胞死亡量約10%,24h后死亡量達(dá)30%,具有明顯的時效關(guān)系。 2.與對照組相比,TNF-α處理后的B16細(xì)胞內(nèi),可見許多不同階段的自體吞噬泡。 3.與對照組相比,TNF-α處理12h的B16細(xì)胞中,自噬標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ和自噬性死亡標(biāo)志性蛋白Beclinl的表達(dá)顯著升高,24h較12h降低但仍高于對照組。3-MA+TNF-α處理組,12h時LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達(dá)水平較TNF-α處理組12h下降,24h較TNF-α處理組24h升高。 4.自噬相關(guān)基因Atg5、Atg7、Atg12mRNA在TNF-α處理12h、24h后表達(dá)水平均顯著升高；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵基因Chop mRNA表達(dá)顯著上調(diào),呈時問依賴性。 5.與對照組相比,TNF-α處理組中p70S6K磷酸化水平顯著下降,呈時間依賴性；Akt磷酸化水平顯著降低,24h較12h升高。3-MA+TNF-α處理組中,p70S6K磷酸化水平在12h較TNF-α處理組升高,24h較TNF-α處理組降低；Akt磷酸化水平較TNF-α處理24h稍低。 結(jié)論 1.TNF-α除了可以誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡,還可以誘導(dǎo)B16細(xì)胞發(fā)生自體吞噬。 2.TNF-α誘導(dǎo)B16細(xì)胞的自噬作用達(dá)到一定水平后,自噬體的數(shù)量不再增加,自噬體的降解逐漸增多,從而導(dǎo)致自噬體數(shù)量下降。 3.TNF-α可以誘導(dǎo)B16細(xì)胞自噬性死亡。 4.TNF-α通過mTOR通路和PI3K/Akt通路誘導(dǎo)B16細(xì)胞自噬。 5.TNF-α可以導(dǎo)致B16細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。有研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以導(dǎo)致細(xì)胞自噬。TNF-α是否可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致B16細(xì)胞自噬有待進(jìn)一步研究。
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【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉曉翌,劉建軍;Caspase與細(xì)胞凋亡[J];武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2004年06期

2 張松齡,唐宏;自體吞噬——Ⅱ型程序性死亡[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2005年11期

3 季紅斌,翟琦巍,劉新垣,鄭仲承;bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào);2000年02期

4 徐振宇,李強(qiáng),李悅欣,劉爽,于常海;自體吞噬在細(xì)胞死亡中的角色[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2004年04期

5 張志才;邵增務(wù);;自噬分子機(jī)制的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2008年01期

6 薩其拉,羅玉英,劉孟珉;TRAIL及其受體在細(xì)胞凋亡中的作用[J];中國生物工程雜志;2000年01期

7 楊周岐;孟芮;王哲;張維;商澎;;PGE2抑制腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2011年01期

8 李璽;牛萬成;花嶸;張召輝;;細(xì)胞死亡概念的發(fā)展及啟示[J];醫(yī)學(xué)與哲學(xué)(人文社會醫(yī)學(xué)版);2007年01期

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本文編號：2325190