發(fā)布時間：2018-11-07 07:44

【摘要】：背景 C型凝集素樣受體如NKG2D和CD94/NKG2由于它們共刺激T細胞增殖和細胞因子分泌的能力而被認為是一種新的T細胞刺激分子。C型凝集素家族具有獨特的糖基識別結構域（cysteine rich domain，CRD），這種糖基識別結構域被稱為C型凝集素樣結構域。 實驗表明，C型凝集素樣分子，包括NK細胞受體CD94/NKG2A和NKG2D，，NKRP1家族成員和CD69,在先天和適應性免疫反應中扮演重要角色。通過與其配體相互結合，C型凝集素樣受體能夠在NK細胞和其他細胞中扮演多種角色。C型凝集素受體成員在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮多種功能，病原體識別調(diào)節(jié)，NK細胞和T細胞的刺激，細胞運輸和骨的形成。 破骨細胞抑制凝集素相關蛋白（2osteoclast inhibitory lectinrelated protein2, OCILRP2）是破骨細胞抑制凝集素（OCIL）家族的成員之一,屬于Ⅱ型跨膜糖蛋白,具有較小的胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū), OCIL家族成員的胞外區(qū)均包含一個C型凝集素樣的結構域。OCILRP2是一種新的C型凝集素。小鼠OCILrP2基因位于6號染色體的NK基因復合體內(nèi)。OCIL家族包括OCIL(Clrb)、OCILrP1(Clrd)和OCILrP2(Clrg)3個基因,其胞外區(qū)具有很高的同源性(約80%)。 OCILRP2主要在免疫組織器官中表達,在小鼠脾臟和胸腺中高水平表達，在其他器官如大腦、心臟、肝臟、腎臟、睪丸、肺、胎盤和肌肉等均未檢測到OCILRP2的表達；其中主要在B細胞和樹突狀細胞（DC）中呈高表達，在未活化的T細胞中幾乎很少表達,但在T細胞被活化后其表達水平明顯上升。初步研究表明, OCILRP2可作為T細胞的共刺激分子,在T細胞的活化過程中發(fā)揮一定作用，且OCILRP2是與其配體NKRP1f相互配合在T細胞的活化過程中發(fā)揮共刺激作用的。 T細胞活化能夠快速誘導OCILRP2的產(chǎn)生，并在72小時內(nèi)保持相當高的水平。OCILRP2的配體NKRP1f在樹突狀細胞顯著表達。可溶性的OCILRP2-IgFc重組蛋白能夠在體內(nèi)和體外顯著抑制特異性抗原刺激對T細胞的增殖，白介素2（IL-2）的產(chǎn)生；相反，抗原遞呈細胞表達的NKRP1f通過與OCILRP2共刺激增強B7.1/CD28介導的T細胞的增值。 但是有關OCILRP2在T細胞共刺激中的作用機制目前尚不清楚。 目的 探討OCILRP2-IgFc融合蛋白在哺乳動物中國倉鼠卵巢細胞（CHO）中的穩(wěn)定分泌表達及其表達產(chǎn)物的純化和鑒定，利用純化鑒定后的OCILRP2-IgFc融合蛋白免疫宿主動物制備特異性的抗OCILRP2抗體。 方法 利用脂質(zhì)體2000為轉染媒介，將OCILRP2-IgFc重組質(zhì)粒轉染哺乳動物細胞CHO細胞，經(jīng)G418抗性培養(yǎng)基加壓篩選、克隆化培養(yǎng)、ELISA測定，獲得穩(wěn)定表達OCILRP2-IgFc融合蛋白的細胞克��； 穩(wěn)定轉染的CHO細胞在培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)，適時更換無血清無動物組織培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)5-7天后收集培養(yǎng)上清，培養(yǎng)上清經(jīng)低溫高速離心和0.45微米濾膜過濾后上Protein A柱進行親和層析純化；利用BCA、SDS-PAGE、Western blot、ELISA、質(zhì)譜分析等方法對純化得到的融合蛋白濃度、純度、分子量、抗原特異性進行測定和鑒定。 使用流式細胞術及ELISA等檢測方法對獲得的重組蛋白OCILRP2的生物學活性進行分析。 用純化得到的OCILRP2-IgFc融合蛋白加弗氏完全佐劑（CFA）或不完全佐劑（IFA）乳化免疫雄性的新西蘭白兔制備抗OCILRP2的抗血清，利用飽和硫酸銨（SAS）鹽析和ProteinG親和層析純化獲得特異性抗OCILRP2的多克隆抗體。 結果 建立穩(wěn)定分泌表達OCILRP2-IgFc融合蛋白的CHO細胞系。 利用Protein A親和層析純化獲得OCILRP2-IgFc融合蛋白，SDS-PAGE可見兩條蛋白主帶，一條分子量為55kDa,另一條分子量為40kDa， Western blot可在同樣位置檢測到該兩條蛋白與HRP標記的山羊抗人Ig/Fc抗體特異性結合，將上述兩條蛋白條帶進行質(zhì)譜分析均含有OCILRP2和標簽Fc的氨基酸序列，證實純化得到的蛋白為OCILRP2-IgFc融合蛋白。 制備的OCILRP2-IgFc融合蛋白能有效抑制T細胞增殖、IL-2的分泌、OCILRP2表達等。 ELISA、Western blot均證實制備的兔抗OCILRP2抗體與純化得到的融合蛋白OCILRP2-IgFc的兩個主條帶發(fā)生特異性結合。 結論 在CHO細胞中成功地建立了穩(wěn)定分泌表達OCILRP2-Ig Fc融合蛋白的細胞系；制備了具有生物學活性的重組OCILRP2-IgFc融合蛋白。制備出特異性的抗OCILRP2抗體。
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【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2315676