【摘要】：一、背景 細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲病原體以及這些病原體的代謝產(chǎn)物所引起的感染性疾病,迄今仍然是人類死亡和傷殘的主要原因之一,每年全球引起1700萬(wàn)以上的新發(fā)病例。 尿路感染(Urinary tract infection, UTIs)是臨床感染中第二位的感染。女性因生理原因,較男性易感。大約有81%的UTIs發(fā)生在女性,年齡在16到35歲之間,30歲的婦女中有1/3-1/4都有過(guò)急性尿路感染的病史,并且復(fù)發(fā)率高。其次,UTIs也是免疫力低下人群常見(jiàn)的感染性疾病。尿路感染按解剖部位不同分為尿道下部感染和上行性感染,前者包括尿道炎和膀胱炎,后者指腎盂腎炎。腎盂腎炎是尿路感染最嚴(yán)重的形式,當(dāng)病史超過(guò)半年至一年就有轉(zhuǎn)成慢性腎盂腎炎的可能性,而慢性腎盂腎炎久治不愈是腎功能衰竭較常見(jiàn)的原因之一。 尿路致病性大腸埃希菌(Uropathogenic Escherichia coli, UPEC)引起的UTIs占80%-90%大部分尿路致病菌都起源丁腸道,并經(jīng)尿道上行至膀胱,約95%的UTIs的起始感染部位是膀胱。目前主要的研究重點(diǎn)是圍繞UPEC與宿主之間的關(guān)系展開(kāi)的。UPEC與其它致病性大腸埃希菌一樣,染色體上具有毒力因子信息。UPEC相關(guān)毒力因子包括：α-溶血素、細(xì)胞壞死因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白等；一方面,細(xì)菌通過(guò)這些毒力因子在宿主中達(dá)到存活繁殖的目的；另一方面宿主利用機(jī)體免疫系統(tǒng),防御來(lái)自細(xì)菌的攻擊,發(fā)生炎癥反應(yīng)；在不斷的相互作用過(guò)程中,細(xì)菌產(chǎn)生一些酶抵抗來(lái)自宿主的防御系統(tǒng)。比如,本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)UPEC毒力因子ompT可水解人固有免疫成分人防御素,從而為細(xì)菌在宿主體內(nèi)存活提供條件。在尿路感染中,細(xì)胞因子是宿主免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一大類能在細(xì)胞間傳遞信息、具有免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)功能的蛋白質(zhì)或小分子多肽。本文以尿路感染動(dòng)物模型為基礎(chǔ),擴(kuò)展思路,測(cè)定宿主不同組織細(xì)胞因子的表達(dá)水平,為進(jìn)一步深入尿路感染的機(jī)制提供依據(jù)。UPEC對(duì)宿主尿路上皮細(xì)胞的粘附能力是其致病的最重要因素,莢膜、脂多糖等一些粘附器官及粘附素的表達(dá)常常是致病的關(guān)鍵,其有助于UPEC結(jié)合于尿路進(jìn)而避免被尿液沖刷清除。本次試驗(yàn)研究表明：ompT基因的敲除,可能導(dǎo)致FimH基因表達(dá)的下調(diào)；FimH是一種已經(jīng)驗(yàn)證的粘附素,并且前期體內(nèi)及體外結(jié)果也表明,ompT基因的敲除可使UPEC粘附率下降,與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。UPEC毒力因子的存在和毒力的大小決定了所致疾病的種類和嚴(yán)重程度；以相同方法,比較ompT對(duì)其他毒力基因的調(diào)控,也在本文中做了初步探討。這些毒力基因功能多與粘附、侵襲、血清抗性和代謝等相關(guān),并在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中證實(shí)。關(guān)于ompT調(diào)控這些毒力因子的相關(guān)機(jī)制還未得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)。 本研究利用前期RED同源重組系統(tǒng)構(gòu)建的尿路致病性大腸桿菌CFT073的ompT基因敲除株(CFT073ΔompT),并將ompT基因連接至低拷貝質(zhì)粒pUCT中構(gòu)建回補(bǔ)株(ompT/pUCT),考察ompT基因的缺失對(duì)致病株抵抗人防御素的影響。并通過(guò)參考文獻(xiàn)及蛋白功能預(yù)測(cè)得到,ompT通過(guò)調(diào)控某些毒力蛋白前體成分的表達(dá)而在尿路感染中起作用；并且通過(guò)熒光定量PCR驗(yàn)證ompT基因劉‘主要毒力蛋白表達(dá)的影響。本課題的目的在于初步研究基因ompT在尿路致病性大腸桿菌的致病機(jī)理中所起到的作用。 二、研究方法 1、人防御素HBD-4克隆、表達(dá)以及鑒定 為進(jìn)一步研究OmpT在尿路感染致病機(jī)理中所起的作用,克隆表達(dá)人β類防御素HBD-4模擬體外感染環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)以膀胱癌細(xì)胞總RNA為模板,PCR擴(kuò)增HBD-4基因,連接至pET-28a,構(gòu)建表達(dá)載體pET28a-HBD-4。(?)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后HBD-4表達(dá)。純化后恢復(fù)蛋白活性。通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)。 2、人防御素HBD-4抑菌活性檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸埃希菌CFT073、CFT073△ompT和ompT/pUCT(CFU：1×106)40μl接種于的LB培養(yǎng)基中,再加入10μl防御素蛋白HBD-4孵育,使每管HBD-4蛋白的終濃度為200μg/ml。將培養(yǎng)物37℃孵育8h,間隔一小時(shí)在600nm處測(cè)定各管的吸光度。將各管稀釋106倍后均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上,37℃孵育過(guò)夜后菌落計(jì)數(shù)。每種細(xì)菌均做副管。 3、尿路感染動(dòng)物模型的建立 經(jīng)尿路分別灌注CFT073及CFT073△ompT,建立尿路感染小鼠動(dòng)物模型,繼續(xù)飼喂12h,觀察小鼠活動(dòng)情況。12h后處死小鼠,腹部消毒,取出膀胱；用PBS清洗5-10次；加入1ml PBS后勻漿,勻漿液作1：1000、1：10000、1：100000梯度稀釋。取出10μ1稀釋液均勻涂布于LB平板,12h后菌落計(jì)數(shù)。 4、尿路感染細(xì)胞因子的檢測(cè) C57小鼠隨機(jī)分組,按尿路灌注方法分別接種野生株細(xì)菌、敲除株細(xì)菌以及回補(bǔ)株細(xì)菌,細(xì)菌接種完畢12h后分別取小鼠血液、腎臟及膀胱組織。血液樣本離心20rmin(2000-3000rpm/min),仔細(xì)收集上清；腎臟及膀胱組織分別加入1m1PBS緩沖液勻漿,離心,取上清。將上述樣品分別加入預(yù)制酶標(biāo)包被板中,按試劑盒說(shuō)明書操作,溫浴、洗滌、加酶、顯色后,終止反應(yīng)。置入酶標(biāo)儀,以空白孔校正,450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算各組細(xì)胞因子水平。 5.ompT基因的調(diào)控作用 由于Ⅰ型菌毛中FimH為證實(shí)的粘附素,因此利用qPCR定量CFT073以及CFT073△ompT中fimH表達(dá)情況。CFT073以及CFT073ΔompT培養(yǎng)過(guò)夜,離心加TRIzol裂解,有機(jī)溶劑抽提總RNA,反轉(zhuǎn)錄；以16s-RNA為內(nèi)參基因,SYBR-Green染料法計(jì)算野生株與敲除株中fimH基因的表達(dá)量是否有差異。以相同方法分別計(jì)算兩種細(xì)菌中ompA、Hly、CNF1的表達(dá)的差異。 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析利用SPSS13.0軟件,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為a=0.05,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。防御素對(duì)CFT073、CFT073ΔompT及ompT/pUCT的抑菌作用采用單向方差分析(One-Way ANOVA);野生株及敲除株中fimH、ompA、Hly、CNF1的表達(dá)差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-Samples T test)。 三、結(jié)果 1、HBD-4的表達(dá) 成功構(gòu)建表達(dá)載體pET28a-HBD-4,轉(zhuǎn)化入工程菌BL21中,成功表達(dá)純化并復(fù)性HBD-4。 2、防御素對(duì)CFT073、CFT073ΔompT及ompT/pUCT抑菌作用 經(jīng)稀釋106倍后菌落計(jì)數(shù)觀察,CFT073組有269±19個(gè)菌落形成單位,CFT073ΔompT組有5+4個(gè)菌落形成單位,ompT/pUCT組有232±19個(gè)菌落形成單位；各組方差齊,F=259.3,P0.001,按a=0.05水準(zhǔn),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,認(rèn)為三組間菌落形成單位總體均數(shù)不全相等,多重比較顯示,ompT敲除株菌落形成單位明顯少于野生株及回補(bǔ)株。 觀察生長(zhǎng)曲線,防御素劉CFT073△ompT有較強(qiáng)的抑制,在波長(zhǎng)600處OD值變化小。CFT073生長(zhǎng)基本不受影響,ompT/pUCT雖然生長(zhǎng)受到影響,但總體依然呈增殖狀態(tài)。 3、野生和敲除株細(xì)菌在小鼠體內(nèi)存活數(shù)的比較 通過(guò)小鼠膀胱灌注,以及菌落計(jì)數(shù)。經(jīng)多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)。分析結(jié)果顯示,X2=20.099,v=2,P0.001,三組間差異有顯著性意義。野生株小鼠體內(nèi)存活平均秩次為23.00,突變株為14.00,表明ompT基因敲除后細(xì)菌體內(nèi)存活數(shù)減少。 4、測(cè)定小鼠組織中細(xì)胞因子水平 尿路感染小鼠動(dòng)物模型建模成功。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子,在血漿中,三組細(xì)胞因子水平不同(F=12.268,P0.05)；兩兩比較后,敲除株與野生株不同,回補(bǔ)株與野生株不同,初步認(rèn)為在血液中,三組細(xì)菌所致炎癥程度不同,野生株強(qiáng)于敲除株及回補(bǔ)株。在腎臟組織中,三組細(xì)菌因子水平不同(F=6.155,P0.05)；兩兩比較后,敲除株與野生株不同,回補(bǔ)株與野生株不同,初步認(rèn)為在腎臟組織中,三組細(xì)菌所致炎癥程度不同,野生株強(qiáng)于敲除株及回補(bǔ)株。在膀胱組織中,三組細(xì)菌因子水平還不能認(rèn)為不同,三組細(xì)菌所致炎癥程度相當(dāng)。 5、omp T對(duì)毒力基因表達(dá)的調(diào)控 相對(duì)熒光定量顯示,野生株fimH基因表達(dá)量是敲除株的79倍。另外比較野生株和敲除株內(nèi)參基因16s-rRNA的光密度,t=-1.006,P0.05,野生株和敲除株光密度之間無(wú)差異,表明RNA提取無(wú)差異；所以,野生株fimH基因表達(dá)可能強(qiáng)于敲除株,ompT敲除可能下調(diào)了fimH基因的表達(dá)。相同方法擴(kuò)增野生株和敲除株中ompA基因后,野生株ompA基因表達(dá)可能強(qiáng)于敲除株；ompT可能同樣影響基因ompA的表達(dá)。相同方法分析Hly基因,野生株Hly基因表達(dá)可能強(qiáng)于敲除株；表明ompT對(duì)基因Hly的表達(dá)有一定影響。相同方法分析CNF1基因,野生株CNF1基因表達(dá)可能強(qiáng)于敲除株；ompT可能影響基因CNF1的表達(dá)。 四結(jié)論 1、成功表達(dá)純化復(fù)性HBD-4后,ompT(?)敲除株較野生株及回補(bǔ)株對(duì)HBD-4更敏感；ompT可通過(guò)水解人防御素,有利于UPEC在尿路中存活。 2、在成功構(gòu)建小鼠尿路感染模型的基礎(chǔ)上,通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,ompT基因的敲除可影響細(xì)菌體內(nèi)存活及體內(nèi)炎癥反應(yīng)。 3、熒光定量PCR表明,ompT基因的敲除下調(diào)了fimH的表達(dá)。表明ompT基因可能通過(guò)影響FimH的表達(dá)而在粘附中起作用。相同方法分析,ompT可能對(duì)ompA基因、hly基因及CNF1基因的表達(dá)也有影響。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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1 惠長(zhǎng)野;郭妍;吳書馳;彭亮;曹虹;黃勝和;;大腸桿菌K1致病株外膜蛋白T體外功能[J];微生物學(xué)報(bào);2010年01期

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本文編號(hào)：2303147