【摘要】：胃腸道中含有大量的微生物,其中包括細(xì)菌、真菌、酵母和寄生蟲(chóng)等。腸道正常菌群參與機(jī)體的生理、生化及病理過(guò)程,與機(jī)體形成互惠互利、相互協(xié)調(diào)又相互制約的動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系,同時(shí)腸道正常菌群在腸黏膜表面構(gòu)成一個(gè)重要的免疫屏障,可有效抵御外來(lái)病原體的入侵和繁殖等。腸道中的抗菌肽或蛋白也是宿主重要的防御性分子,在防止宿主發(fā)生感染和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮著積極作用,其中包括Mucin、Intelectin、溶菌酶和防御素等。自噬(autophage)是繼凋亡(apoptosis)后,當(dāng)前生命科學(xué)最熱的研究領(lǐng)域,是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性的降解途徑,在機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育和疾病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,對(duì)天然免疫和獲得性免疫具有一定的調(diào)節(jié)作用。 旋毛形線蟲(chóng)(Trichinella spiralis,旋毛蟲(chóng))感染為胃腸道紊亂病理生理學(xué)的研究提供了一個(gè)很好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?在過(guò)去的十年中,人們利用旋毛蟲(chóng)感染大鼠或小鼠模型來(lái)研究免疫和腸道生理系統(tǒng)的相互關(guān)系以及相關(guān)機(jī)理等。目前,人們著重于研究細(xì)菌和腸黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生相互作用后腸道抗菌肽表達(dá)水平的變化,而對(duì)于寄生蟲(chóng)感染后抗菌肽表達(dá)水平的變化,是否引起自噬現(xiàn)象的發(fā)生,以及腸道菌群變化的研究較少,此外,這三者之間的相互關(guān)系等尚不清楚。因此,為了探討旋毛蟲(chóng)ISS534感染BALB/c小鼠的腸道免疫應(yīng)答機(jī)制,本研究對(duì)旋毛蟲(chóng)感染BALB/c小鼠后腸道內(nèi)細(xì)胞因子、抗菌肽、自噬以及菌群變化等相關(guān)宿主防御反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。 6-8周齡BALB/c小鼠經(jīng)口感染300尾旋毛蟲(chóng)ISS534幼蟲(chóng)／只,在感染7d和14d后斷頸處死小鼠,采集空腸和結(jié)腸進(jìn)行體外組織培養(yǎng),培養(yǎng)18h后收集腸組織培養(yǎng)上清,通過(guò)ELISA方法對(duì)IL-10、IL-12、IL-6、IL-17、IFN-y和TNF-a等細(xì)胞因子的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)一步驗(yàn)證了旋毛蟲(chóng)感染小鼠后機(jī)體的免疫反應(yīng)是體液免疫和細(xì)胞免疫協(xié)同作用結(jié)果,其中以Th2型免疫反應(yīng)為主。之后,采集小鼠空腸和結(jié)腸進(jìn)行石蠟切片,經(jīng)HE染色后觀察,可見(jiàn)旋毛蟲(chóng)ISS534感染BALB/c小鼠空腸中杯狀細(xì)胞數(shù)量增加；Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,由杯狀細(xì)胞分泌的Intelectin和Mucinl,潘氏細(xì)胞分泌的溶菌酶和鼠防御素-1表達(dá)量增加,說(shuō)明抗菌肽在宿主感染旋毛蟲(chóng)后引發(fā)的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著積極作用。此外,利用Western blot方法對(duì)自噬體膜標(biāo)志性蛋白LC3B表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)旋毛蟲(chóng)ISS534感染BALB/c小鼠空腸和結(jié)腸中LC3B表達(dá)量均增高,尤其是感染后結(jié)腸中LC3B表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著增加,這說(shuō)明在寄生蟲(chóng)感染情況下,自噬很可能也參與了機(jī)體的免疫防御反應(yīng)。根據(jù)不同細(xì)菌的16S rRNA序列設(shè)計(jì)特異性引物,構(gòu)建陽(yáng)性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品,應(yīng)用Real-time PCR方法對(duì)旋毛蟲(chóng)ISS534感染BALB/c小鼠腸道中的乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、腸球菌屬和梭菌屬細(xì)菌進(jìn)行定量分析,比較旋毛蟲(chóng)感染小鼠與正常對(duì)照之間腸道菌群差異。該試驗(yàn)結(jié)果表明,旋毛蟲(chóng)ISS534感染BALB/c小鼠后可引起腸道菌群失調(diào)。
[Abstract]:The gastrointestinal tract contains a large number of microorganisms, including bacteria, fungi, yeast, and parasites. the intestinal normal bacteria group participates in the physiological, biochemical and pathological processes of the organism and forms a dynamic balance relationship with the body to form mutual benefit, mutual coordination and mutual restriction, and meanwhile, the intestinal normal bacteria group forms an important immune barrier on the surface of the intestinal mucosa, can effectively resist invasion and propagation of foreign pathogens and the like. The antibacterial peptide or protein in the intestinal tract is also an important defensive molecule of the host, and plays an active role in preventing the host from infecting and maintaining homeostasis, including Mucin, Inelectroin, Lysozyme and Defensin. Since autophagy is the most hot research field of life science after apoptosis, it is a kind of lysosome-dependent degradation pathway widely present in eukaryotic cells, which plays an important role in organism growth, development and disease process. It has a certain regulating effect on innate immunity and immunity. Trichinella spiralis (Trichinella spiralis, Trichinella spiralis) infection provides a good experimental model in the study of gastrointestinal disorder pathophysiology, In the past ten years, people use Trichinella spiralis infection rats or mouse models to study the correlation between the immune and intestinal physiological systems and the correlation Mechanism and so on. At present, people focus on studying the change of the expression level of antibacterial peptide after the interaction of bacteria and intestinal mucosa epithelial cells, and whether the change of the expression level of antibacterial peptide after the parasite infection causes autophagy, and little research on intestinal flora changes. In addition, the relations among the three are not yet Therefore, in order to explore the mechanism of intestinal immune response in BALB/ c mice infected with Trichinella spiralis ISS534, this study has been used to investigate the immune response to cytokines, antibacterial peptides, autophagy and changes of bacteria group in BALB/ c mice infected with trichinella spiralis. 6-8 week old BALB/ c mice were infected with 300 tail trichinella spiralis ISS534 larvae/ only, the mice were sacrificed after 7 days after infection and 14 days after infection, the samples were collected in vitro for culture in vitro and cultured in vitro for 18h, IL-10, IL-12, IL-12, IL-12 and IL-12 were collected by ELISA. 6. The expression of cytokines such as IL-17, IFN-y and TNF-a were detected, and the immune response of the mice after Trichinella spiralis infection was further verified to be the result of humoral immunity and cellular immunity. After HE staining, the number of goblet cells was increased in BALB/ c mice infected with Trichinella spiralis ISS534, and the results of Real-time PCR showed that, compared with the control group, Inelectroin, which was secreted by cup-shaped cells, was observed after HE staining. and the expression amount of the lysozyme and the mouse defensin-1 secreted by the Mucinl and Panshi cells is increased, and the immune response induced by the antibacterial peptide after the host infection is infected In addition, the expression level of L3B was detected by Western blot, and the expression level of L3B in the jejunal and colon of BALB/ c mice infected with Trichinella spiralis was increased, especially the expression of L3B in the colon after infection and control. This indicates that autophagy is likely to be involved in the body as compared to a significant increase The specific primers were designed according to 16S rRNA sequence of different bacteria to construct a positive plasmid as a standard. Quantitative analysis of bacteria to compare mice infected with Trichinella spiralis with normal control The results showed that the ISS534 infected with Trichinella spiralis could lead to BALB/ c mice.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2278515