【摘要】：研究背景 任何生命體系中都存在負反饋調節(jié)。在免疫系統(tǒng)中,目前普遍認為,調節(jié)性T細胞(Treg cells)在下調輔助性T細胞的免疫活動,維持多種生理狀態(tài)下的免疫平衡中發(fā)揮重要作用。調節(jié)性T細胞可有力地保持免疫系統(tǒng)對生理性或病理性自身抗原的耐受作用,控制自身免疫反應的強度及范圍,防止、降低機體對病原或過敏原免疫應答的失控和反應過度；協(xié)助調節(jié)機體內必需的微生物菌叢的穩(wěn)態(tài)；同時,調節(jié)性T細胞還參與了腫瘤細胞的免疫逃逸機制,促進腫瘤細胞脫離免疫系統(tǒng)的監(jiān)控,從而加快了腫瘤組織的生長與擴散。 目前在實驗小鼠中,基于細胞表面抗原,已經被分離、鑒定出來的最重要的一類調節(jié)性T細胞,是CD4+CD25+T細胞亞群。機體內自然生成的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞,在胸腺中發(fā)育、成熟為具有特定功能的T細胞群,并表達叉狀頭/翼狀螺旋轉錄因子(forhead-winged helix transcription factor, Foxp3).Foxp3在調節(jié)性T細胞的發(fā)生發(fā)展及免疫調節(jié)功能中有關鍵性的作用。Foxp3+調節(jié)性T細胞也通過αβT細胞受體識別抗原；在組成上,這種T細胞受體具有與普通T細胞相似但又有其獨特性的TCR譜型。 調節(jié)性T細胞的作用機制具有多態(tài)性,目前已研究發(fā)現(xiàn)多種作用模式及多種媒介因子參與調節(jié)性T細胞的免疫調節(jié)功能,包括：通過抑制性細胞因子,通過細胞毒作用,通過干擾細胞代謝及通過介導樹突狀細胞等抗原遞呈細胞的成熟與功能等等。 調節(jié)性T細胞是免疫系統(tǒng)的重要成分,尤其在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用,掌握調節(jié)性T細胞的作用機制具有相當重要的意義。目前關于調節(jié)性T細胞的研究多建立在炎癥及腫瘤發(fā)生發(fā)展的環(huán)境中,比如消化系統(tǒng)中的炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease, IBD)及炎癥相關性癌(inflammation-associated cancers)。有學者提出自身免疫性疾病的衛(wèi)生假說(hygiene hypothesis),其中包括消化道的感染導致具有免疫調節(jié)功能的T細胞數(shù)量或功能的變化,是炎癥性腸病等慢性炎癥疾病及炎癥相關結腸癌的發(fā)病機制之一；也有研究者提出,調節(jié)性T細胞同時也可通過IL-10等抑制性細胞因子的作用下調消化道炎癥反應,維持消化道免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài),而降低消化道腫瘤的風險。 本論文著重探討CD24分子對調節(jié)性T細胞免疫抑制功能的影響。CD24是一種表達于人及小鼠多種細胞表面的低分子糖蛋白,特征之一是其細胞表面錨定的磷脂酰肌醇高度糖基化,不同組織分離的CD24分子具有不同的分子重量,提示其不同的組織環(huán)境下獨特的細胞功能。由于其熱穩(wěn)定性,鼠CD24又被稱熱穩(wěn)定蛋白。CD24表達于多種類型的細胞表面,主要于造血系統(tǒng),包括發(fā)育中的T細胞和大部分B細胞,抗原遞呈細胞等；CD24還表達于非造血系統(tǒng),包括神經系統(tǒng),上皮細胞和多種類型的腫瘤細胞等等。多數(shù)情況下,CD24以較高的水平表達于祖細胞或代謝旺盛的細胞,較低水平地表達于分化成熟細胞。 CD24分子在大部分細胞類型上的功能還不甚清楚。目前已有文獻報道CD24在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮多種不同的介導作用。有作者報道,盡管T細胞在發(fā)育、成熟的過程中下調CD24的表達量,但其在TCR-CD3復合體介導的抗原抗體反應中可快速上調CD24的表達。還有研究者發(fā)現(xiàn)表達于抗原遞呈細胞表面的CD24通過參與共刺激調節(jié)通路,介導CD4、CD8T細胞免疫反應；還有文章提出表達于T細胞的CD24是T細胞穩(wěn)態(tài)增殖的必要條件。 最先發(fā)表CD24與自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展有關聯(lián)的報道是,CD24缺陷的小鼠對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)的誘導、發(fā)生具有高度抵抗性。進一步研究發(fā)現(xiàn)CD24的基因多態(tài)性與多種自身免疫性疾病的發(fā)生、進展具有相關性,包括多發(fā)性硬化、風濕性關節(jié)炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡。CD24調節(jié)自身免疫性疾病的機制仍待研究。 此外,有關CD24的另一個研究熱點集中在腫瘤領域。CD24高表達于多種類型的腫瘤組織,包括小細胞性肺癌,肝細胞性肝癌,乳腺癌等。CD24是一種重要的腫瘤診斷及預后標志物。有學者發(fā)現(xiàn),細胞表面及細胞內CD24的表達與乳腺癌的不良預后、組織病理學分級、腫瘤大小和淋巴轉移活性等有重要相關性。但是,仍需要大量的研究來深入探討CD24在腫瘤發(fā)病機理中的作用。 目前,關于CD24分子在免疫系統(tǒng)中的作用還存在許多爭議,CD24對T細胞的作用還不清楚。此外,關于CD24與調節(jié)性T細胞功能的研究報道甚少�；贑D24分子與T細胞功能的相關性,本論文利用CD24缺陷型轉基因小鼠,從外周分離出CD4+CD25+細胞作為我們研究中的調節(jié)性T細胞,試圖通過多個水平,探討CD24對CD4+CD25+調節(jié)性T細胞免疫抑制功能的影響。在小鼠體內實驗中,我們借助EAE小鼠模型,研究CD24缺陷型調節(jié)性T細胞對自身免疫反應的影響。希望通過多層面探討CD24分子對調節(jié)性T細胞免疫抑制功能的影響,為自身免疫性疾病的診斷、治療提供新的思路。 實驗方法 1.定量分析野生型與CD24缺陷型小鼠調節(jié)性T細胞中Foxp3的表達差異及其T細胞受體型譜。 1.1實驗分組：根據(jù)不同背景、不同基因型、不同組織進行實驗分組為野生型(Wild type, WT)脾細胞組、CD24缺陷型(CD24knock out, CD24-/-)脾細胞組、WT胸腺細胞組、CD24-/-胸腺細胞組。同時于BALB/c及C57BL6小鼠中進行,分別比較。 1.2用血細胞計數(shù)板計算脾、胸腺器官細胞總數(shù)。 1.3應用流式細胞術,進行細胞表面(抗CD4抗體)及細胞內(抗Foxp3抗體)熒光染色,結果以CD4+Foxp3+細胞百分比及CD4+Foxp3+細胞總數(shù)表示,定量比較兩種小鼠的脾組織、胸腺組織中Foxp3表達量的差異。 1.4應用流式細胞術,進行細胞表面熒光染色,定量比較兩種小鼠的脾組織、胸腺組織中CD4+和CD8+T細胞的T細胞受體型譜。 1.5應用流式細胞術,進行細胞表面(抗CD4、抗CD24抗體)及細胞內(抗Foxp3抗體)熒光染色,檢測CD24在CD4+Foxp3+細胞表面的表達量。 1.6應用流式細胞術,進行細胞表面熒光染色,定量比較兩種小鼠的脾組織、胸腺組織中CD4+Foxp3+細胞的T細胞受體型譜(抗TCR vβ2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14抗體)。 2.觀察比較野生型與CD24缺陷型小鼠的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞的體外免疫調節(jié)功能的差異。 2.1實驗分組：WT.Treg組和CD24-/-.Treg組,同時于BALB/c及C57BL6小鼠中進行,分別比較。 2.2FACS法或MACS法分離CD4+CD25+調節(jié)性T細胞 制備WT或CD24-/-小鼠的脾和淋巴組織的單細胞懸液,根據(jù)試劑公司操作指南,應用熒光激活細胞分選法(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)或免疫磁珠細胞分選法(MACS microbeads)分離出CD4+CD25+T細胞作為本實驗的調節(jié)性T細胞(regulatory T cell, Treg), CD4+CD25-細胞作為普通T細胞(conventional T cell, Tconv)。 2.33H胸腺嘧啶核苷滲入法比較WT和CD24-/-CD4+CD25+Treg細胞的體內免疫抑制功能。 3H胸腺嘧啶核苷滲入法([3H]-TdR)的淋巴細胞增殖抑制(Suppression assay)試驗,以每孔約50000個CD4+CD25-Tconv細胞接種在96孔板,按不同Effector cell:Target cell比例,即Tconv:Treg比例(1：1,2：1,4：1,8：1,16：1及空白對照)接種CD4+CD25+Treg細胞,以2000Rad照射的Rag-1或Rag-2缺陷脾細胞作抗原遞呈細胞(antigen presenting cell, APC),培養(yǎng)約60h；加入[3H]-TdR,0.1μ Ci/well繼續(xù)培養(yǎng)8-16小時,測定攝入3H值CPM,比較不同Treg細胞對Tconv細胞體外增殖的影響。 2.4熒光定量RT-PCR測定細胞因子水：IL-2、IL-10、TGF-β、P35、EBI-3。 分離出調節(jié)性T細胞后,按照QIAGEN RNeasy Mini Kit步驟要求提取細胞中總RNA。將提取的總RNA應用SuperScript(?)Ⅲ First-Strand Synthesis System進行逆轉錄,獲得cDNA。按照QuantiTect SYBR Green PCR kit熒光定量試劑盒步驟要求,配置反應體系。每個細胞每種啟動子設置3個復孔。熒光定量PCR檢測儀進行目的片段擴增和熒光信號檢測,反應條件為：第一步95℃15s,第二步56℃,30s,72℃30s,共40個循環(huán)；反應過程中自動收集熒光。 2.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定培養(yǎng)基中細胞因子水平：IL-2、IFN-γ、 IL-10。 3.觀察比較野生型和CD24缺陷型調節(jié)性T細胞在EAE小鼠模型體內的免疫調節(jié)功能。 3.1實驗小鼠分組：WT.Treg注射組、CD24-/-.Treg注射組、空白對照組或陽性對照組(只注射CD4+CD25-T細胞)。 3.2依上述MACS法分離CD4+CD25+調節(jié)性T細胞 3.3MOG蛋白誘導C57BL6小鼠建立EAE小鼠模型 1)MOG誘導當天為第0天：于C57BL6小鼠兩側臀部皮下注射100μLMOG混合乳劑[200μg MOG35-55(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein,髓鞘少突膠質細胞糖蛋白)]+CFA(含400μg/ml結核分枝桿菌),隨后馬上尾靜脈注射200μL PBS(含150ng百日咳毒素)；同時尾靜脈注射1x106CD24-/-Tconv細胞和0.5x106WT或CD24-/-Treg細胞。 2)第2天：尾靜脈注射200μL毒素。 3)每日觀察實驗小鼠,按照5分法進行EAE臨床評分：0,無明顯異常；1分,鼠尾萎軟或后肢無力(非同時出現(xiàn)鼠尾萎軟和后肢無力)；2分,鼠尾完全萎軟伴后肢無力或伴后肢部分麻痹；3分,后肢完全麻痹；4分,后肢完全麻痹伴前肢無力或麻痹；5分,四肢癱瘓或垂死。 4統(tǒng)計學處理 在EAE模型中,僅作結果的描述,不作統(tǒng)計學分析。其余數(shù)據(jù)以mean±SD(x±s)表示,采用t檢驗(student's t test),包括配對樣本t檢驗(paired t test)、獨立樣本t檢驗(independent sample t test)和單樣本t檢驗(one sample t test:當某一組樣本量不足,結果只有一個常數(shù)時)。當P0.05認定差異具有統(tǒng)計學顯著性。 實驗結果 1CD24分子對小鼠淋巴器官發(fā)育的影響分析 1.1CD24分子對小鼠胸腺發(fā)育的影響分析 Balb/c.CD24-/-小鼠的胸腺組織體積較WT組�。环殖�10周、10周兩組進行胸腺總細胞計數(shù),Balb/c.CD24-/-小鼠的胸腺細胞總數(shù)均比WT小鼠的少,分別為t=2.529、P=0.045和t=4.642、P=0.002。在C57BL6中,WT和CD24-/-兩種小鼠的胸腺細胞總數(shù)沒有顯著性差異,分別為t=0.061、P=0.954和t=1.606、P=0.169。 1.2CD24分子對胸腺細胞克隆選擇的影響 進行TCR vβ熒光染色,整體上,CD24-/-小鼠的胸腺細胞及脾淋巴細胞的T細胞受體譜型與WT小鼠相當,只有個別亞群體現(xiàn)出數(shù)量上的差別。比如C57BL6.CD24-/-小鼠胸腺CD4+細胞中TCRvβ11、vβ12細胞比例下降(分別為t=3.183、P=0.010; t=4.518、P=0.002),提示在WT小鼠中,CD24可能參與TCR vβ11、vβ12T細胞的克隆去除的逃逸。 2Foxp3在CD24-/-小鼠的表達及其T細胞受體譜型分析 2.1Foxp3細胞內染色及流式細胞術分析 Balb/c.CD24-/-小鼠脾細胞的Foxp3表達百分比低于WT小鼠,t=4.932、 P0.001; CD24-/-的Foxp3+細胞數(shù)量也相對較低,t=5.144、P0.001。在胸腺組織中,Balb/c.CD24-/-小鼠的Foxp3表達比與WT小鼠相當,P0.05；但CD24-/-Foxp3+細胞數(shù)量低于WT,t=2.574、P=0.022。而在C57BL6種系小鼠中,CD24-/-脾、胸腺細胞中的Foxp3表達百分比及Foxp3+細胞總量均高于WT小鼠,但只有胸腺細胞中的Foxp3+細胞總量的差異具有統(tǒng)計學意義,t=3.394、P=0.009。 2.2Foxp3+調節(jié)性T細胞的TCR譜型分析 與總T細胞TCR譜型結果近似,CD24-/-小鼠的Foxp3+Treg細胞的TCR Vβ整體上與WT Treg細胞無明顯差異,個別亞群如Balb/c小鼠中的vβ4、vβ7, C57BL6小鼠中的vβ3、vβ12有數(shù)量上的變化。 3CD24在Treg細胞表面的表達情況 以CD24-／-細胞及抗IgG2b Isotype抗體作參照,CD24在胸腺、脾、淋巴組織中的Treg細胞表面亦有一定水平的表達。 4CD24對Treg細胞體外免疫抑制功能的影響 4.1淋巴細胞增殖抑制試驗 在Balb/c小鼠中,CD24-/-Treg細胞比WT.Treg細胞具有更強的增殖抑制功能,這種差異主要發(fā)生在CD24-/-.Tconv作Effector cell且高濃度Treg (Tconv: Treg為1：1)的環(huán)境中：WT.Treg和CD24-/-.Treg對WT.Tconv的增殖抑制率分別是31.134±5.67%和45.479±3.955%,t=3.594,P=0.023；對CD24-/-.Tconv的抑制率分別是33.122+4.931%和57.345+2.595%,t=4.931,P=0.002。在C57BL種系小鼠中,WT.Treg和CD24-/-.Treg對WT.Tconv的抑制率沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)；而在CD24-/-.Tconv作Effector cell的培養(yǎng)體系中,其結果與Balb/c小鼠相吻合,在高濃度Treg細胞條件下,WT.Treg和CD24-/-.Treg的增殖抑制率分別是6.873±5.439%和43.156±6.629%,t=4.981、P=0.016。 使用CD24-/-.Tconv及CD24-/-APC,在細胞培養(yǎng)的最初加入不同濃度(10μg/ml、5μg/ml)的抗CD24封閉抗體(a-CD24), WT.Treg的抑制率增高,且抑制率提高具有抗體濃度依賴性；但是差異不具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 4.2CD24對細胞因子表達的影響 在熒光定量rt-PCR中,以WT.Tconv細胞的mRNA水平為參照,CD24-/-.Treg細胞較WT.Treg表達更高水平的IL-10、TGF-p和EBI-3mRNA,分別為t=10.457、P0.001; t=16.332、P0.001和t=5.846、P=0.004。高表達的抑制性細胞因子可能是CD24-/-.Treg細胞表現(xiàn)出更強的增殖抑制功能的作用機制之一。 在各細胞亞群培養(yǎng)上清中,WT和CD24-/-的Tconv、Treg的IL-2、IFN-γ分泌量無明顯差異(P0.05)。CD24-/-Treg的上清中檢測到更高濃度的IL-10, t=5.416、P=0.006,提示CD24-/-.Treg細胞可能比WT.Treg細胞分泌更多的IL-10。 在Tconv和Treg細胞共培養(yǎng)體系中,CD24-/-.Treg細胞的培養(yǎng)上清中檢測到的IL-2、IFN-γ濃度低于WT.Treg細胞的上清,在CD24-/-.Tconv的培養(yǎng)系統(tǒng)中,分別是t=101.717、P0.001和t=5.800、P=0.004,差異具有統(tǒng)計學意義。共培養(yǎng)體系中的IL-10產生量無顯著差異,P0.05。 5CD24對Treg細胞體內免疫抑制功能的影響 靜脈注射多克隆的CD24-/-.Tconv細胞5x106/mouse,及0.37x106/mouse的Treg細胞,可觀察到注射WT.Treg細胞的小鼠發(fā)病較早,且平均分較CD24-/-.Treg細胞注射組高。在另一組實驗中,MOG誘導EAE的同時,靜脈注射單克隆的2D2.CD24-/-.Tconv細胞1x106/mouse,及0.50x106/mouse的Treg細胞(成分不變),兩組小鼠全部發(fā)病,WT.Treg細胞的小鼠發(fā)病較早,臨床平均分較CD24-/-.Treg細胞注射組高。提示在小鼠體內CD24-/-.Treg細胞比WT.Treg細胞可能發(fā)揮更高的免疫抑制作用,CD24-/-.Treg細胞對EAE的保護作用更強。 討論 CD24分子在胸腺細胞的發(fā)育過程起到一定的作用；整體上,CD24-/-T細胞的TCR譜型與WT相當,僅有個別亞群有數(shù)量上的差別。不同種系小鼠中CD24對Foxp3的數(shù)量的影響略有差別；體外實驗中,CD24-/-調節(jié)性T細胞具有更強的增殖抑制功能,但是這種增強可被Tconv上CD24的表達部分抵消。關于細胞因子的研究中,CD24-/-.Treg細胞可通過高分泌IL-10、TGF-β、IL-35等抑制性細胞因子發(fā)揮更強的免疫抑制功能；而在與Tconv的接觸中,可能通過多種作用,影響了與增殖和功能相關的IL-2、IFN-γ等細胞因子,進而抑制Tconv細胞的作用。EAE模型的體內實驗中,對多克隆Tconv或2D2單克隆Tconv,均觀察到CD24-/-.Treg細胞比WT.Treg細胞發(fā)揮更高的免疫抑制作用,對EAE疾病的保護作用更強,主要表現(xiàn)在延緩EAE的發(fā)病,減輕EAE的發(fā)病程度,但不足以防治EAE。CD24分子的研究可為基于調節(jié)性T細胞的自身免疫性疾病的防治中提供新的思路。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392

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本文編號：2277887