發(fā)布時間：2018-10-16 14:24

【摘要】：文章采用兼并引物逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)從特異性分泌抗人c-Met阻斷型單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株3E1D7中擴增抗體重、輕鏈可變區(qū)基因(V_H和V_L)。通過重疊延伸PCR(splice overlap extension PCR,SOE-PCR)方法分別將鼠源V_H與人IgG1的重鏈恒定區(qū)基因Cγ1相連,鼠源V_L與人IgG1的輕鏈恒定區(qū)基因Cκ相連獲得嵌合抗體重鏈基因(H)和輕鏈基因(L)。將嵌合抗體重、輕鏈基因連接到慢病毒表達(dá)載體中,經(jīng)雙酶切和測序鑒定成功構(gòu)建了慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pRRL-CMV-ch3E-H和pRRL-CMVch3E-L。磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,表達(dá)的嵌合抗體經(jīng)Protein A Sepharose 4B親和層析柱純化,通過SDSPAGE檢測抗體的完整性,ELISA法檢測嵌合抗體的特異性抗原結(jié)合活性及人源性。感染慢病毒的293T細(xì)胞上清純化后,經(jīng)SDS-PAGE分析,可見25kDa嵌合抗體輕鏈和50kDa的嵌合抗體重鏈蛋白。且純化后的嵌合抗體能夠與c-Met抗原特異性結(jié)合成功獲得重組抗人c-Met嵌合抗體,該抗體減少了鼠源成分,降低了免疫原性,利用慢病毒可以快速獲得大量重組抗體蛋白,為該抗體藥物的體內(nèi)外評估奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:The anti-body weight and light chain variable region genes (VH and VL) were amplified by degenerate primer reverse transcriptase (PCR (reverse transcription PCR,RT-PCR) from hybridoma cell line 3E1D7 which specifically secreted monoclonal antibody against human c-Met blocking type (VH and VL). By overlapping extension PCR (splice overlap extension PCR,SOE-PCR), mouse VH was linked to human IgG1 heavy chain constant region gene C 緯 1, and mouse origin VL was linked to human IgG1 light chain constant region gene C 魏 to obtain chimeric antibody heavy chain gene (H) and light chain gene (L). The chimeric anti-body weight and light chain genes were ligated into the lentivirus expression vector. The lentivirus expression plasmids pRRL-CMV-ch3E-H and pRRL-CMVch3E-L. were successfully constructed by double enzyme digestion and sequencing. The chimeric antibody was purified by Protein A Sepharose 4B affinity chromatography column. The integrity of the antibody was detected by SDSPAGE. The specific antigen-binding activity and human origin of chimeric antibody were detected by ELISA method. After purification of 293T cells infected with lentivirus, 25kDa chimeric antibody light chain and 50kDa chimeric antibody heavy chain protein were found by SDS-PAGE analysis. The purified chimeric antibody could be successfully combined with c-Met antigen to obtain recombinant anti-human c-Met chimeric antibody. The antibody reduced the murine component and the immunogenicity, and a large number of recombinant antibody proteins could be obtained quickly by using lentivirus. To lay the foundation for the in vivo and in vitro evaluation of the antibody drug.
【作者單位】： 同濟大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院;煙臺榮昌制藥股份有限公司;
【基金】：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項目(81402399) 中央高�；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助項目(2000219121) 江蘇省自然科學(xué)基金資助項目(BK2012162)
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2274644