發(fā)布時間：2018-10-16 20:03

【摘要】：產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens, C.perfringens)為革蘭氏陽性桿菌,普遍存在于人類和動物的胃腸道或土壤,能廣泛地導致人類和動物發(fā)病,如氣性壞疽、食物中毒、壞死性小腸結(jié)腸炎和壞死性腸炎。C.perfringens根據(jù)分泌毒素類型可分為A、B、C、D和E型,其中A型導致的氣性壞疽是一種發(fā)展迅猛、破壞性極大的感染,當感染超過一定濃度的C.perfringens即可迅速蔓延至全身,甚至危害生命。二戰(zhàn)期間,由于戰(zhàn)傷及感染C.perfringens,使氣性壞疽猶如瘟疫般蔓延和發(fā)展。在現(xiàn)代,氣性壞疽常發(fā)生在地震災(zāi)害及車禍患者的傷口深部感染中。在臨床醫(yī)學上,由于C.perfringens感染后發(fā)病的迅猛和不可控性,常常需要截肢以保存生命,嚴重的損害了患者的心理與勞動能力。 由于氣性壞疽的發(fā)病呈驟急性,一個早期、快速檢測深部產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的方法學的建立是十分必要的。目前,醫(yī)學上常用于檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌的方法有培養(yǎng)法、生化鑒定法、酶聯(lián)免疫法、質(zhì)粒體分析法,這些技術(shù)被用于檢測和鑒定的前提均以培養(yǎng)和分離細菌為前提,大大的增加獲得陽性結(jié)果的時間,延誤了最佳的治療時機。鑒于目前存在的問題,本課題擬在其它研究的基礎(chǔ)上,建立小鼠氣性壞疽的動物模型,了解氣性壞疽的感染發(fā)病規(guī)律,旨在對C.perfringens實時熒光PCR法在實踐中的檢測價值進行研究和探討。 第一部分：C.perfringens實時熒光PCR法的建立 由于16SrDNA在種間的高度保守性,使之成為細菌檢測的可靠標志物。建立C.perfringens實時熒光PCR法,首先選擇C.perfringens16SrDNA序列的保守區(qū)設(shè)計引物,擴增目的片段長度約為105bp�；厥漳康钠魏笾苯訙y序,經(jīng)Blast比對與C.perfringens16SrRNA基因[AB566417]一致。針對目的片段設(shè)計特異的寡核苷酸探針,優(yōu)化后的體系采用14個梯度濃度的C.perfringens菌液對本試驗的敏感度和穩(wěn)定性進行驗證。結(jié)果成功的檢測出1014cfu/mL～101cfu/mL的C.perfringens菌液,檢測下限為101cfu/mL,平行檢測整體CV均數(shù)為0.014±0.014,CV95%可信區(qū)間為(0.006-0.022) 第二部分：ATCC13124毒力試驗 A型C.perfringens為導致氣性壞疽的主要生物型。其中ATCC13124為首先從人類氣性壞疽病人中分離出來的實驗室標準株,在患者中能產(chǎn)生大量壞疽毒素。在小鼠氣性壞疽動物模型建立之前,首先對ATCC13124菌株的毒力進行驗證。毒力試驗分為外毒素毒力試驗與細菌毒力試驗。 C.perfringens外毒素毒力試驗中,體外培養(yǎng)使ATCC13124在PY培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量的外毒素,通過離心將細菌沉淀,粗制得細菌外毒素溶液。外毒素以小鼠體重為單位經(jīng)尾靜脈注射小鼠,通過小鼠的死亡率與外毒素劑量的關(guān)系,采用Bliss法計算出ATCC13124的外毒素對昆明小鼠的半數(shù)致死量為13.3mL/kg,95%可信區(qū)間為(11.4～15.7)mL/kg。 C.perfringens細菌毒力試驗中,配制一系列濃度梯度的ATCC13124菌液(5.7×109cfu/mL、5.7×108cfu/mL、5.7×107cfu/mL、5.7×106cfu/mL和5.7×105cfu/mL)取1mL分別注射到小鼠腹腔,觀察小鼠死亡率、生存時間分布及細菌感染情況。結(jié)果5.7×109cfu/mL組、5.7×108cfu/mL組、5.7×107cfu/mL組、5.7×106cfu/mL組、5.7×105cfu/mL組和對照組的死亡率依次為：100%、90%、10%、0%、0%和0%,整體死亡率有顯著性差異(χ2=51.900,P0.001) 組間死亡率進行兩兩比較：腹腔注射細菌濃度為5.7×109cfu/mL組(χ2=20.000,P0.001,校正P0.001)、5.7×108cfn/mL組(χ2=16.364,P0.001,校正P0.001)導致小鼠的死亡率與對照組有顯著性差異。腹腔注射細菌濃度為5.7×107cfu/mL組與對照組的死亡率無顯著性差異(χ2=1.053,P=0.305,校正P=1.000) 腹腔注射細菌濃度為5.7×109cfu/mL組和5.7×108cfu/mL組導致小鼠的死亡率無顯著性差異(χ2=1.053,P=0.305,校正P=1.000)。腹腔注射細菌濃度為5.7×109cfu/mL組與5.7×107cfu/mL組(χ2=16.364,P0.001,校正P0.001)、5.7×106cfu/mL組(X2=20.000,P0.001,校正P0.001)、5.7×105cfu/mL組(χ2=20.000,P0.001,校正P0.001)導致小鼠的死亡率有顯著性差異。 腹腔注射細菌濃度為5.7×108cfu/mL組與5.7×107cfu/mL組(χ2=12.800,P0.001,校正P0.001)、5.7×106cfu/mL組(χ2=16.364,P0.001,校正P0.001)、5.7×105cfu/mL組(χ2=20.000,P0.001,校正P0.001)導致小鼠的死亡率有顯著性差異。 腹腔注射細菌濃度為5.7×107cfu/mL組與5.7×106cfu/mL組(χ2=1.053,P=0.305,校正P=1.000)5.7×105cfu/mL組(χ2=1.053,P=0.305,校正P=1.000)導致小鼠的死亡率無顯著性差異。 5.7×109cfu/mL組小鼠存活時間中位數(shù)為1.000h,95%可信區(qū)間為(1.000～2.167)h;5.7×108cfu/mL組小鼠死亡時間中位數(shù)為2.333h,95%可信區(qū)間為(1.688-2.797)h。采用Log rank法對細菌毒力試驗小鼠生存時間分布的整體比較,三種菌液濃度導致小鼠的生存時間分布有顯著性差異(χ2=32.963,P0.001)。水平間的兩兩比較,5.7×109cfu/mL組與5.7×108cfu/mL組(χ2=9.886,P=0.002)、5.7×109cfu/mL組與5.7×107cfu/mL組(χ2=22.550,P0.001)5.7×108cfu/mL組與5.7×107cfu/mL組(χ2=14.875,P0.001),不同濃度組兩兩比較小鼠的生存時間分布有顯著性差異。 5.7×109cfu/mL組與5.7×108cfu/mL組死亡小鼠表現(xiàn)為皮膚呈現(xiàn)由蒼白變?yōu)榍嚆~逐漸變成紫紅色或黑色,全身性的毒血癥；腹部膨脹充氣,解剖后可聞到硫化氫的氣味,腸道充氣膨脹呈透明狀。5.7×107cfu/mL組死亡的小鼠均表現(xiàn)為皮膚稍變紫色,腸道感染,腸道稍微膨脹充氣：未死亡小鼠腸道正常,不發(fā)病。5.7×106cfu/mL組、5.7×105cfu/mL組和對照組腸道正常。 第三部分：小鼠氣性壞疽動物模型的建立與實時熒光PCR法的應(yīng)用 本部分采用A型C.perfringens典型代表的標準株ATCC13124,選用具有統(tǒng)計學價值的SPF級昆明小鼠作為試驗動物建立氣性壞疽動物模型,旨在為C.perfringens實時熒光PCR法的應(yīng)用提供可統(tǒng)計分析的動物模型,探究其實踐的應(yīng)用價值。 本部分采用肌注法建立無創(chuàng)傷情況下單一感染的小鼠氣性壞疽動物模型。配制一系列濃度梯度的ATCC13124菌液(3.5×109cfu/mL、3.5×108cfu/mL、3.5×107cfu/mL)于小鼠右后肢膝關(guān)節(jié)上1/3處肌肉注射0.1mL菌液,對照組肌肉注射0.1mL的生理鹽水,觀察細菌感染進展。 3.5×109cfu/mL組、3.5×108cfu/mL組、3.5×107cfu/mL組和對照組的死亡率依次為：100%、70%、10%和0%,整體死亡率有顯著性差異(χ2=27.879,P0.001)。肌肉注射細菌濃度為3.5×109cfu/mL組(χ2=20.000,P0.001,校正P0.001)、3.5×108cfu/mL組(χ2=10.769,P=0.001,校正P=0.006)的死亡率與對照組有顯著性差異。肌肉注射細菌濃度為3.5×107cfu/mL組死亡率與對照組無顯著性差異(χ2=1.053,P=0.305,校正P=1.000) 肌肉注射細菌濃度為3.5×109cfu/mL與3.5×108cfu/mL的死亡率無顯著性差異(χ2=3.529,P=0.060,校正P=0.360)。肌肉注射細菌濃度為3.5×109cfu/mL與3.5×107cfu/mL組的小鼠死亡率有顯著性差異(χ2=16.364,P0.001,校正P0.001)。 肌肉注射細菌濃度為3.5×108cfu/mL與3.5×107cfu/mL的小鼠死亡率有顯著性差異(χ2=7.5,P=0.006,校正P=0.036) 3.5×109cfu/mL組小鼠的存活時間中位數(shù)為15.000h,存活時間95%可信區(qū)間為(11.901～18.099)h;3.5×108cfu/mL組小鼠的存活時間中位數(shù)為21.000h,存活時間95%可信區(qū)間為(14.802-27.198)h。 采用Log rank法對3組壞疽模型小鼠生存時間分布整體比較,整體的生存時間分布有顯著性差異(χ2=20.922,P0.001)。水平間兩兩比較,3.5×10’cfu/mL組與3.5×108cfu/mL組間(χ2=4.062,P=0.044)3.5×109cfu/mL組與3.5×107cfu/mL組間(χ2=20.284,P0.001)、3.5×108cfu/mL組與3.5×107cfu/mL組間(χ2=8.006,P0.005)均有顯著性差異,接種不同濃度的壞疽模型小鼠的生存時間分布兩兩比較有顯著性差異。 肌肉注射不同濃度的ATCC13124菌液癥狀如下：3.5×109cfu/mL組在注射的12小時內(nèi)均表現(xiàn)為紅腫,僵直不能運動,紅腫從下肢逐漸蔓延至上肢及股部,后肢表現(xiàn)為皮膚紫紅有淤血聚集,全身性毒血癥,后肢按壓有氣泡碾碎聲,剖開皮膚可聞到硫化氫氣味,全部小鼠出現(xiàn)血尿。3.5×108cfu/mL組死亡小鼠后肢感染情況與3.5×109cfu/mL組相似,但癥狀較輕,表現(xiàn)為紅腫,僵直不能運動,隨后紅腫從下肢逐漸蔓延至上肢及股部,后肢表現(xiàn)為皮膚紫紅有淤血聚集,但無全身性毒血癥,不出現(xiàn)血尿,感染部位按壓無氣泡碾碎聲。3.5×108cfu/mL組未死亡的小鼠表現(xiàn)為后肢紅腫,48h后康復(fù)無任何癥狀。3.5×107cfu/mL組只有1只小鼠死亡,癥狀表現(xiàn)與3.5×108cfu/mL組死亡小鼠一致。3.5×107cfu/mL組存活的小鼠表現(xiàn)為后肢紅腫,36h后康復(fù)無任何癥狀；對照組后肢表現(xiàn)正常無任何癥狀。 采用了傳統(tǒng)的細菌學方法革蘭氏染色鏡檢、細菌厭氧培養(yǎng)和厭氧菌鑒定系統(tǒng)對動物模型進行驗證。3.5×109cfu/mL組、3.5×108組與3.5×107cfu/mL組死亡的小鼠均能觀察到革蘭氏陽性,兩端鈍圓的粗大桿菌,并可看到芽孢位于細菌的一端正在形成。3.5×107cfu/mL組存活小鼠與對照組無任何革蘭氏陽性菌。分泌物細菌厭氧培養(yǎng),3.5×109cfu/mL組、3.5×108cfu/mL組與3.5×107cfu/mL組死亡的小鼠能培養(yǎng)出菌落,菌落特征為邊緣粗糙透明凸起的菌落,菌落外周可見有清晰的溶血環(huán)。3.5×107cfu/mL組存活小鼠與對照組無任何細菌。小鼠氣性壞疽分泌物進行培養(yǎng)后,使用API20A厭氧菌鑒定系統(tǒng)鑒定,結(jié)果鑒定為C.perfringens。 采用C.perfringens實時熒光PCR法對氣性壞疽動物模型分泌物進行檢測,試驗組均為陽性,對照組均為陰性。3.5×109cfu/mL組、3.5×108cfu/mL組、3.5×107cfu/mL組Ct值分別為21.208±2.693、28.454±2.739和32.489±2.874,整體間有顯著差異(F=42.592,P0.001)。組間多重比較顯示：3.5×109cfu/mL組與3.5×108cfu/mL組間(P0.001)、3.5×109cfu/mL組與3.5×107cfu/mL組間(P0.001),3.5×108cfu/mL組與3.5×107cfu/mL組間(P=0.003)各濃度組間Ct值有顯著性差異。 結(jié)論 根據(jù)16SrRNA編碼基因的保守區(qū)設(shè)計引物和探針建立的C.perfringens實時熒光PCR法檢測的靈敏度為1014cfu/mL～101cfu/mL,檢測下限為101cfu/mL。細菌濃度在1014fu/mL～101cfu/mL范圍內(nèi)反應(yīng)體系具有較高的穩(wěn)定性。 對ATCC13124的外毒素進行了初步的研究。PY培養(yǎng)基體外培養(yǎng)能使休眠的ATCC13124毒力恢復(fù)產(chǎn)生外毒素。 小鼠腹腔注射109cfu/mL組與108cfu/mL組均能在1-3小時內(nèi)發(fā)病且迅速死亡。小鼠腹腔注射ATCC13124濃度大于等于108cfu/mL能導致嚴重的腸道壞疽；細菌濃度達到109cfu/mL能導致小鼠100%死亡率；小鼠腹腔注射ATCC13124濃度小于等于107cfu/mL幾乎不發(fā)病。 小鼠肌肉注射0.1mL濃度為108cfu/mL和109cfu/mL能成功建立氣性壞疽動物模型。其中108cfu/mL能在27小時內(nèi)導致70%的小鼠發(fā)生氣性壞疽且死亡。109cfu/mL能在18小時內(nèi)導致100%的小鼠發(fā)生嚴重的氣性壞疽且死亡。107cfu/mL不導致小鼠氣性壞疽。 C.perfringens實時熒光PCR法的靈敏度較革蘭氏染色鏡檢、細菌厭氧培養(yǎng)法靈敏度高。通過Ct值可推斷氣性壞疽感染的菌落濃度指導臨床實踐。C.perfringens實時熒光PCR法檢測結(jié)果為陽性,但Ct值較高時,提示C.perfringens感染濃度較低或者細菌已死亡,小鼠可通過自身免疫力消除而并不導致氣性壞疽。因此在臨床診斷過程中,C.perfringens實時熒光PCR法檢測出陽性但Ct值較高時,需結(jié)合臨床癥狀作出診斷。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R-332

【參考文獻】

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1 蔡剛;實時定量PCR應(yīng)用中的問題及優(yōu)化方案[J];國外醫(yī)學.臨床生物化學與檢驗學分冊;2003年06期

2 張志明;孫海英;李建平;;16S rRNA在醫(yī)學微生物鑒定中的應(yīng)用[J];國際檢驗醫(yī)學雜志;2010年04期

3 馬章林;唐曙明;樓許柏;;16SrRNA在醫(yī)學微生物鑒定中的應(yīng)用探討　[J];吉林醫(yī)學;2011年12期

4 姜曉東;閻政禮;周桂鳳;;R程序在Bliss法計算半數(shù)致死量中的運用[J];實用預(yù)防醫(yī)學;2011年03期

5 王興民，王成懷;酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測A型產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素[J];微生物學免疫學進展;1994年02期

6 周琳;張杰;;群落分析中的16S rRNA及其基因16S rDNA優(yōu)化擴增[J];微生物學報;2010年01期

7 彭建國,強京寧,方建強;犬產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離和PCR檢測方法的建立[J];中國獸醫(yī)科技;2004年12期

8 柴同杰,馬瑞華,常維山,張紹學;產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌病的流行與致病機制[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學報;2001年01期

9 孟曉靜,龔書明,蘇明權(quán),孫怡群,于文彬;用聚合酶鏈反應(yīng)法檢測水中產(chǎn)氣莢膜梭菌[J];中華預(yù)防醫(yī)學雜志;2000年03期

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本文編號：2275487