【摘要】：產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens, C.perfringens)為革蘭氏陽(yáng)性桿菌,普遍存在于人類和動(dòng)物的胃腸道或土壤,能廣泛地導(dǎo)致人類和動(dòng)物發(fā)病,如氣性壞疽、食物中毒、壞死性小腸結(jié)腸炎和壞死性腸炎。C.perfringens根據(jù)分泌毒素類型可分為A、B、C、D和E型,其中A型導(dǎo)致的氣性壞疽是一種發(fā)展迅猛、破壞性極大的感染,當(dāng)感染超過(guò)一定濃度的C.perfringens即可迅速蔓延至全身,甚至危害生命。二戰(zhàn)期間,由于戰(zhàn)傷及感染C.perfringens,使氣性壞疽猶如瘟疫般蔓延和發(fā)展。在現(xiàn)代,氣性壞疽常發(fā)生在地震災(zāi)害及車(chē)禍患者的傷口深部感染中。在臨床醫(yī)學(xué)上,由于C.perfringens感染后發(fā)病的迅猛和不可控性,常常需要截肢以保存生命,嚴(yán)重的損害了患者的心理與勞動(dòng)能力。 由于氣性壞疽的發(fā)病呈驟急性,一個(gè)早期、快速檢測(cè)深部產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的方法學(xué)的建立是十分必要的。目前,醫(yī)學(xué)上常用于檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的方法有培養(yǎng)法、生化鑒定法、酶聯(lián)免疫法、質(zhì)粒體分析法,這些技術(shù)被用于檢測(cè)和鑒定的前提均以培養(yǎng)和分離細(xì)菌為前提,大大的增加獲得陽(yáng)性結(jié)果的時(shí)間,延誤了最佳的治療時(shí)機(jī)。鑒于目前存在的問(wèn)題,本課題擬在其它研究的基礎(chǔ)上,建立小鼠氣性壞疽的動(dòng)物模型,了解氣性壞疽的感染發(fā)病規(guī)律,旨在對(duì)C.perfringens實(shí)時(shí)熒光PCR法在實(shí)踐中的檢測(cè)價(jià)值進(jìn)行研究和探討。 第一部分：C.perfringens實(shí)時(shí)熒光PCR法的建立 由于16SrDNA在種間的高度保守性,使之成為細(xì)菌檢測(cè)的可靠標(biāo)志物。建立C.perfringens實(shí)時(shí)熒光PCR法,首先選擇C.perfringens16SrDNA序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度約為105bp。回收目的片段后直接測(cè)序,經(jīng)Blast比對(duì)與C.perfringens16SrRNA基因[AB566417]一致。針對(duì)目的片段設(shè)計(jì)特異的寡核苷酸探針,優(yōu)化后的體系采用14個(gè)梯度濃度的C.perfringens菌液對(duì)本試驗(yàn)的敏感度和穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果成功的檢測(cè)出1014cfu/mL～101cfu/mL的C.perfringens菌液,檢測(cè)下限為101cfu/mL,平行檢測(cè)整體CV均數(shù)為0.014±0.014,CV95%可信區(qū)間為(0.006-0.022) 第二部分：ATCC13124毒力試驗(yàn) A型C.perfringens為導(dǎo)致氣性壞疽的主要生物型。其中ATCC13124為首先從人類氣性壞疽病人中分離出來(lái)的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)株,在患者中能產(chǎn)生大量壞疽毒素。在小鼠氣性壞疽動(dòng)物模型建立之前,首先對(duì)ATCC13124菌株的毒力進(jìn)行驗(yàn)證。毒力試驗(yàn)分為外毒素毒力試驗(yàn)與細(xì)菌毒力試驗(yàn)。 C.perfringens外毒素毒力試驗(yàn)中,體外培養(yǎng)使ATCC13124在PY培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量的外毒素,通過(guò)離心將細(xì)菌沉淀,粗制得細(xì)菌外毒素溶液。外毒素以小鼠體重為單位經(jīng)尾靜脈注射小鼠,通過(guò)小鼠的死亡率與外毒素劑量的關(guān)系,采用Bliss法計(jì)算出ATCC13124的外毒素對(duì)昆明小鼠的半數(shù)致死量為13.3mL/kg,95%可信區(qū)間為(11.4～15.7)mL/kg。 C.perfringens細(xì)菌毒力試驗(yàn)中,配制一系列濃度梯度的ATCC13124菌液(5.7×109cfu/mL、5.7×108cfu/mL、5.7×107cfu/mL、5.7×106cfu/mL和5.7×105cfu/mL)取1mL分別注射到小鼠腹腔,觀察小鼠死亡率、生存時(shí)間分布及細(xì)菌感染情況。結(jié)果5.7×109cfu/mL組、5.7×108cfu/mL組、5.7×107cfu/mL組、5.7×106cfu/mL組、5.7×105cfu/mL組和對(duì)照組的死亡率依次為：100%、90%、10%、0%、0%和0%,整體死亡率有顯著性差異(χ2=51.900,P0.001) 組間死亡率進(jìn)行兩兩比較：腹腔注射細(xì)菌濃度為5.7×109cfu/mL組(χ2=20.000,P0.001,校正P0.001)、5.7×108cfn/mL組(χ2=16.364,P0.001,校正P0.001)導(dǎo)致小鼠的死亡率與對(duì)照組有顯著性差異。腹腔注射細(xì)菌濃度為5.7×107cfu/mL組與對(duì)照組的死亡率無(wú)顯著性差異(χ2=1.053,P=0.305,校正P=1.000) 腹腔注射細(xì)菌濃度為5.7×109cfu/mL組和5.7×108cfu/mL組導(dǎo)致小鼠的死亡率無(wú)顯著性差異(χ2=1.053,P=0.305,校正P=1.000)。腹腔注射細(xì)菌濃度為5.7×109cfu/mL組與5.7×107cfu/mL組(χ2=16.364,P0.001,校正P0.001)、5.7×106cfu/mL組(X2=20.000,P0.001,校正P0.001)、5.7×105cfu/mL組(χ2=20.000,P0.001,校正P0.001)導(dǎo)致小鼠的死亡率有顯著性差異。 腹腔注射細(xì)菌濃度為5.7×108cfu/mL組與5.7×107cfu/mL組(χ2=12.800,P0.001,校正P0.001)、5.7×106cfu/mL組(χ2=16.364,P0.001,校正P0.001)、5.7×105cfu/mL組(χ2=20.000,P0.001,校正P0.001)導(dǎo)致小鼠的死亡率有顯著性差異。 腹腔注射細(xì)菌濃度為5.7×107cfu/mL組與5.7×106cfu/mL組(χ2=1.053,P=0.305,校正P=1.000)5.7×105cfu/mL組(χ2=1.053,P=0.305,校正P=1.000)導(dǎo)致小鼠的死亡率無(wú)顯著性差異。 5.7×109cfu/mL組小鼠存活時(shí)間中位數(shù)為1.000h,95%可信區(qū)間為(1.000～2.167)h;5.7×108cfu/mL組小鼠死亡時(shí)間中位數(shù)為2.333h,95%可信區(qū)間為(1.688-2.797)h。采用Log rank法對(duì)細(xì)菌毒力試驗(yàn)小鼠生存時(shí)間分布的整體比較,三種菌液濃度導(dǎo)致小鼠的生存時(shí)間分布有顯著性差異(χ2=32.963,P0.001)。水平間的兩兩比較,5.7×109cfu/mL組與5.7×108cfu/mL組(χ2=9.886,P=0.002)、5.7×109cfu/mL組與5.7×107cfu/mL組(χ2=22.550,P0.001)5.7×108cfu/mL組與5.7×107cfu/mL組(χ2=14.875,P0.001),不同濃度組兩兩比較小鼠的生存時(shí)間分布有顯著性差異。 5.7×109cfu/mL組與5.7×108cfu/mL組死亡小鼠表現(xiàn)為皮膚呈現(xiàn)由蒼白變?yōu)榍嚆~逐漸變成紫紅色或黑色,全身性的毒血癥；腹部膨脹充氣,解剖后可聞到硫化氫的氣味,腸道充氣膨脹呈透明狀。5.7×107cfu/mL組死亡的小鼠均表現(xiàn)為皮膚稍變紫色,腸道感染,腸道稍微膨脹充氣：未死亡小鼠腸道正常,不發(fā)病。5.7×106cfu/mL組、5.7×105cfu/mL組和對(duì)照組腸道正常。 第三部分：小鼠氣性壞疽動(dòng)物模型的建立與實(shí)時(shí)熒光PCR法的應(yīng)用 本部分采用A型C.perfringens典型代表的標(biāo)準(zhǔn)株ATCC13124,選用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)價(jià)值的SPF級(jí)昆明小鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物建立氣性壞疽動(dòng)物模型,旨在為C.perfringens實(shí)時(shí)熒光PCR法的應(yīng)用提供可統(tǒng)計(jì)分析的動(dòng)物模型,探究其實(shí)踐的應(yīng)用價(jià)值。 本部分采用肌注法建立無(wú)創(chuàng)傷情況下單一感染的小鼠氣性壞疽動(dòng)物模型。配制一系列濃度梯度的ATCC13124菌液(3.5×109cfu/mL、3.5×108cfu/mL、3.5×107cfu/mL)于小鼠右后肢膝關(guān)節(jié)上1/3處肌肉注射0.1mL菌液,對(duì)照組肌肉注射0.1mL的生理鹽水,觀察細(xì)菌感染進(jìn)展。 3.5×109cfu/mL組、3.5×108cfu/mL組、3.5×107cfu/mL組和對(duì)照組的死亡率依次為：100%、70%、10%和0%,整體死亡率有顯著性差異(χ2=27.879,P0.001)。肌肉注射細(xì)菌濃度為3.5×109cfu/mL組(χ2=20.000,P0.001,校正P0.001)、3.5×108cfu/mL組(χ2=10.769,P=0.001,校正P=0.006)的死亡率與對(duì)照組有顯著性差異。肌肉注射細(xì)菌濃度為3.5×107cfu/mL組死亡率與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(χ2=1.053,P=0.305,校正P=1.000) 肌肉注射細(xì)菌濃度為3.5×109cfu/mL與3.5×108cfu/mL的死亡率無(wú)顯著性差異(χ2=3.529,P=0.060,校正P=0.360)。肌肉注射細(xì)菌濃度為3.5×109cfu/mL與3.5×107cfu/mL組的小鼠死亡率有顯著性差異(χ2=16.364,P0.001,校正P0.001)。 肌肉注射細(xì)菌濃度為3.5×108cfu/mL與3.5×107cfu/mL的小鼠死亡率有顯著性差異(χ2=7.5,P=0.006,校正P=0.036) 3.5×109cfu/mL組小鼠的存活時(shí)間中位數(shù)為15.000h,存活時(shí)間95%可信區(qū)間為(11.901～18.099)h;3.5×108cfu/mL組小鼠的存活時(shí)間中位數(shù)為21.000h,存活時(shí)間95%可信區(qū)間為(14.802-27.198)h。 采用Log rank法對(duì)3組壞疽模型小鼠生存時(shí)間分布整體比較,整體的生存時(shí)間分布有顯著性差異(χ2=20.922,P0.001)。水平間兩兩比較,3.5×10’cfu/mL組與3.5×108cfu/mL組間(χ2=4.062,P=0.044)3.5×109cfu/mL組與3.5×107cfu/mL組間(χ2=20.284,P0.001)、3.5×108cfu/mL組與3.5×107cfu/mL組間(χ2=8.006,P0.005)均有顯著性差異,接種不同濃度的壞疽模型小鼠的生存時(shí)間分布兩兩比較有顯著性差異。 肌肉注射不同濃度的ATCC13124菌液癥狀如下：3.5×109cfu/mL組在注射的12小時(shí)內(nèi)均表現(xiàn)為紅腫,僵直不能運(yùn)動(dòng),紅腫從下肢逐漸蔓延至上肢及股部,后肢表現(xiàn)為皮膚紫紅有淤血聚集,全身性毒血癥,后肢按壓有氣泡碾碎聲,剖開(kāi)皮膚可聞到硫化氫氣味,全部小鼠出現(xiàn)血尿。3.5×108cfu/mL組死亡小鼠后肢感染情況與3.5×109cfu/mL組相似,但癥狀較輕,表現(xiàn)為紅腫,僵直不能運(yùn)動(dòng),隨后紅腫從下肢逐漸蔓延至上肢及股部,后肢表現(xiàn)為皮膚紫紅有淤血聚集,但無(wú)全身性毒血癥,不出現(xiàn)血尿,感染部位按壓無(wú)氣泡碾碎聲。3.5×108cfu/mL組未死亡的小鼠表現(xiàn)為后肢紅腫,48h后康復(fù)無(wú)任何癥狀。3.5×107cfu/mL組只有1只小鼠死亡,癥狀表現(xiàn)與3.5×108cfu/mL組死亡小鼠一致。3.5×107cfu/mL組存活的小鼠表現(xiàn)為后肢紅腫,36h后康復(fù)無(wú)任何癥狀；對(duì)照組后肢表現(xiàn)正常無(wú)任何癥狀。 采用了傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)方法革蘭氏染色鏡檢、細(xì)菌厭氧培養(yǎng)和厭氧菌鑒定系統(tǒng)對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行驗(yàn)證。3.5×109cfu/mL組、3.5×108組與3.5×107cfu/mL組死亡的小鼠均能觀察到革蘭氏陽(yáng)性,兩端鈍圓的粗大桿菌,并可看到芽孢位于細(xì)菌的一端正在形成。3.5×107cfu/mL組存活小鼠與對(duì)照組無(wú)任何革蘭氏陽(yáng)性菌。分泌物細(xì)菌厭氧培養(yǎng),3.5×109cfu/mL組、3.5×108cfu/mL組與3.5×107cfu/mL組死亡的小鼠能培養(yǎng)出菌落,菌落特征為邊緣粗糙透明凸起的菌落,菌落外周可見(jiàn)有清晰的溶血環(huán)。3.5×107cfu/mL組存活小鼠與對(duì)照組無(wú)任何細(xì)菌。小鼠氣性壞疽分泌物進(jìn)行培養(yǎng)后,使用API20A厭氧菌鑒定系統(tǒng)鑒定,結(jié)果鑒定為C.perfringens。 采用C.perfringens實(shí)時(shí)熒光PCR法對(duì)氣性壞疽動(dòng)物模型分泌物進(jìn)行檢測(cè),試驗(yàn)組均為陽(yáng)性,對(duì)照組均為陰性。3.5×109cfu/mL組、3.5×108cfu/mL組、3.5×107cfu/mL組Ct值分別為21.208±2.693、28.454±2.739和32.489±2.874,整體間有顯著差異(F=42.592,P0.001)。組間多重比較顯示：3.5×109cfu/mL組與3.5×108cfu/mL組間(P0.001)、3.5×109cfu/mL組與3.5×107cfu/mL組間(P0.001),3.5×108cfu/mL組與3.5×107cfu/mL組間(P=0.003)各濃度組間Ct值有顯著性差異。 結(jié)論 根據(jù)16SrRNA編碼基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針建立的C.perfringens實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)的靈敏度為1014cfu/mL～101cfu/mL,檢測(cè)下限為101cfu/mL。細(xì)菌濃度在1014fu/mL～101cfu/mL范圍內(nèi)反應(yīng)體系具有較高的穩(wěn)定性。 對(duì)ATCC13124的外毒素進(jìn)行了初步的研究。PY培養(yǎng)基體外培養(yǎng)能使休眠的ATCC13124毒力恢復(fù)產(chǎn)生外毒素。 小鼠腹腔注射109cfu/mL組與108cfu/mL組均能在1-3小時(shí)內(nèi)發(fā)病且迅速死亡。小鼠腹腔注射ATCC13124濃度大于等于108cfu/mL能導(dǎo)致嚴(yán)重的腸道壞疽；細(xì)菌濃度達(dá)到109cfu/mL能導(dǎo)致小鼠100%死亡率；小鼠腹腔注射ATCC13124濃度小于等于107cfu/mL幾乎不發(fā)病。 小鼠肌肉注射0.1mL濃度為108cfu/mL和109cfu/mL能成功建立氣性壞疽動(dòng)物模型。其中108cfu/mL能在27小時(shí)內(nèi)導(dǎo)致70%的小鼠發(fā)生氣性壞疽且死亡。109cfu/mL能在18小時(shí)內(nèi)導(dǎo)致100%的小鼠發(fā)生嚴(yán)重的氣性壞疽且死亡。107cfu/mL不導(dǎo)致小鼠氣性壞疽。 C.perfringens實(shí)時(shí)熒光PCR法的靈敏度較革蘭氏染色鏡檢、細(xì)菌厭氧培養(yǎng)法靈敏度高。通過(guò)Ct值可推斷氣性壞疽感染的菌落濃度指導(dǎo)臨床實(shí)踐。C.perfringens實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性,但Ct值較高時(shí),提示C.perfringens感染濃度較低或者細(xì)菌已死亡,小鼠可通過(guò)自身免疫力消除而并不導(dǎo)致氣性壞疽。因此在臨床診斷過(guò)程中,C.perfringens實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)出陽(yáng)性但Ct值較高時(shí),需結(jié)合臨床癥狀作出診斷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R-332

【參考文獻(xiàn)】

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1 蔡剛;實(shí)時(shí)定量PCR應(yīng)用中的問(wèn)題及優(yōu)化方案[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè);2003年06期

2 張志明;孫海英;李建平;;16S rRNA在醫(yī)學(xué)微生物鑒定中的應(yīng)用[J];國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2010年04期

3 馬章林;唐曙明;樓許柏;;16SrRNA在醫(yī)學(xué)微生物鑒定中的應(yīng)用探討　[J];吉林醫(yī)學(xué);2011年12期

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6 周琳;張杰;;群落分析中的16S rRNA及其基因16S rDNA優(yōu)化擴(kuò)增[J];微生物學(xué)報(bào);2010年01期

7 彭建國(guó),強(qiáng)京寧,方建強(qiáng);犬產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離和PCR檢測(cè)方法的建立[J];中國(guó)獸醫(yī)科技;2004年12期

8 柴同杰,馬瑞華,常維山,張紹學(xué);產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌病的流行與致病機(jī)制[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2001年01期

9 孟曉靜,龔書(shū)明,蘇明權(quán),孫怡群,于文彬;用聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)水中產(chǎn)氣莢膜梭菌[J];中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2000年03期

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本文編號(hào)：2275487