【摘要】：流感病毒神經(jīng)氨酸酶(NA)具有酶活性,對(duì)病毒入侵和釋放起重要作用。依據(jù)其特性,NA成為研究設(shè)計(jì)抗流感病毒藥物最適合的靶點(diǎn)。目前,雖然有研究不斷地對(duì)NA抑制劑進(jìn)行改進(jìn),但是流感病毒株對(duì)這些藥物依然迅速產(chǎn)生耐藥性。因此,開(kāi)發(fā)新的抗流感藥物和找到新的作用靶點(diǎn)迫在眉睫。在宿主細(xì)胞中,很多宿主蛋白對(duì)流感病毒的復(fù)制過(guò)程都有重要影響。其中小分子G蛋白R(shí)hoGTPases三個(gè)重要的家族成員Cdc42、RhoA和Rac1作為分子開(kāi)關(guān),涉及多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,參與多種細(xì)胞生物活動(dòng)。而且越來(lái)越多的研究表明,它們參與胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)恼{(diào)控。但是它們是否對(duì)NA蛋白胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)起作用,它們中究竟是哪個(gè)蛋白起作用還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。本文對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行了研究。 我們首先通過(guò)觀察NA和NA(H274Y)突變體表達(dá)蛋白在細(xì)胞中定位的改變和檢測(cè)NA(H274Y)突變體表面酶活的降低,建立起NA蛋白胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)研究體系。然后,用藥物Toxin B處理轉(zhuǎn)染NA的細(xì)胞,證實(shí)了Rho GTPases家族成員(Cdc42、 RhoA和Rac1)對(duì)NA蛋白胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)起促進(jìn)作用。隨后我們分別對(duì)Cdc42、RhoA和Rac1及它們相關(guān)持續(xù)活化和阻抑的突變體與NA蛋白的共定位進(jìn)行觀察,以及藥物C3Transferase處理實(shí)驗(yàn),證實(shí)是Cdc42起到促進(jìn)作用。我們外源轉(zhuǎn)入Cdc42一個(gè)特定的GTP酶活化蛋白(GAP)-ARHGAP21,抑制宿主細(xì)胞中Cdc42的活性,進(jìn)一步證實(shí)內(nèi)源Cdc42所起到的促進(jìn)作用。 我們又對(duì)Cdc42與NA蛋白的作用方式進(jìn)行了探究。GST-pulldown試驗(yàn)表明可能Cdc42與NA之間并不存在直接的相互作用。用TGN和GM130分別標(biāo)記高爾基體,Confocal試驗(yàn)表明Cdc42影響了NA蛋白從高爾基體向胞質(zhì)及胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。隨后的Cytochalasin D處理試驗(yàn),揭示Cdc42通過(guò)對(duì)肌動(dòng)蛋白的調(diào)控而影響NA蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。 此外,我們還針對(duì)NA信號(hào)肽區(qū)域,構(gòu)建了一系列的NA缺失突變體。我們發(fā)現(xiàn),當(dāng)NA跨膜區(qū)缺失10個(gè)以上氨基酸時(shí),會(huì)導(dǎo)致NA蛋白不表達(dá)。我們對(duì)NA缺失11氨基酸的突變體進(jìn)行了蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的研究,結(jié)果表明在細(xì)胞內(nèi)的定位并未發(fā)生變化。 上述研究結(jié)果表明,Cdc42在甲型流感病毒NA蛋白修飾及轉(zhuǎn)運(yùn)中起到明顯的促進(jìn)作用。其中Cdc42在NA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。
[Abstract]:Influenza virus neuraminidase (NA) has enzyme activity and plays an important role in virus invasion and release. According to its characteristics, NA has become the most suitable target for the design of anti-influenza drugs. At present, although studies continue to improve the NA inhibitors, influenza virus strains are still rapidly developing drug resistance to these drugs. Therefore, it is urgent to develop new anti-influenza drugs and find new targets. In host cells, many host proteins play an important role in the replication of influenza viruses. Among them, Cdc42,RhoA and Rac1, three important family members of small G protein RhoGTPases, are involved in many cell signal transduction pathways and participate in many cellular biological activities as molecular switches. More and more studies show that they are involved in the regulation of intracellular transport. However, whether they play a role in intracellular transport of NA protein and which of them is involved has not been reported. This paper studies this problem. We first observed the localization of NA and NA (H274Y) mutants in cells and detected the decrease of surface enzyme activity of NA (H274Y) mutants, and established a system of intracellular transport of NA proteins. Then, the cells transfected with NA were treated with Toxin B, which confirmed that Rho GTPases family members (Cdc42, RhoA and Rac1) promoted the intracellular transport of NA protein. Then we observed the co-localization of Cdc42,RhoA and Rac1 and their continuous activation and inhibition with NA protein, as well as the drug C3Transferase treatment. It was proved that Cdc42 played a promoting role. Our exogenous transfer into Cdc42, a specific GTP activator protein, (GAP)-ARHGAP21, inhibited the activity of Cdc42 in host cells, further confirming the role of endogenous Cdc42. We also studied the interaction between Cdc42 and NA protein. GST-pulldown test showed that there was no direct interaction between Cdc42 and NA. TGN and GM130 were used to label Golgi body respectively. Confocal test showed that Cdc42 affected the transport of NA protein from Golgi body to cytoplasm and cell membrane. Subsequently, the Cytochalasin D treatment test revealed that Cdc42 affected the transport of NA protein through the regulation of actin. In addition, we constructed a series of NA deletion mutants for NA signal peptide region. We found that the absence of more than 10 amino acids in the transmembrane region of NA resulted in no expression of NA protein. We studied the protein transport of the mutant with NA deletion of 11 amino acid. The results showed that the localization in the cell had not changed. These results suggest that Cdc42 plays an important role in the modification and transport of NA protein of influenza A virus. The mechanism of Cdc42 in NA protein transport needs further study.
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R373.13

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2274442