【摘要】：疲勞一直以來(lái)都是一個(gè)讓我們熟悉的話題,目前,我們對(duì)于疲勞的理解也已經(jīng)從單純的軀體疲勞擴(kuò)展到精神和認(rèn)知的功能失調(diào)。疲勞作為一種非特異的癥狀不僅存在于許多疾病中(比如多發(fā)性硬化,腫瘤,腦卒中,系統(tǒng)性紅斑狼瘡,缺血性心臟病,重型抑郁等等),并且也可以作為一個(gè)獨(dú)立癥狀存在于普通人群中,尤其是在受過(guò)高等教育的中高級(jí)白領(lǐng)人群中更為普遍。在疲勞的狀態(tài)下,人們的免疫力被嚴(yán)重削弱,從而容易罹患各種感染性疾病;同時(shí)疲勞也會(huì)增加人們患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn),比如誘發(fā)急性心肌梗塞。因此如果能有效地緩解疲勞將會(huì)對(duì)改善我們的工作和生活的質(zhì)量有著極為顯著的意義。 在本研究中,我們運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法在疲勞大鼠模型中篩選到一個(gè)疲勞相關(guān)蛋白:Orosomucoid 1 (ORM 1),通過(guò)在體外合成該蛋白的純品以及siRNA序列進(jìn)行整體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該蛋白具有抗疲勞活性,而大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素由于能有效地誘導(dǎo)該蛋白的體內(nèi)合成也具有抗疲勞活性。另外,對(duì)紅霉素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造獲得的螺縮酮經(jīng)證實(shí)已無(wú)抗菌活性,但仍能誘導(dǎo)ORM 1的表達(dá),延長(zhǎng)小鼠的游泳時(shí)間,從而也具有抗疲勞活性。隨后的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)ORM 1可以通過(guò)增加p-AMPK的表達(dá)來(lái)刺激GLUT4的膜轉(zhuǎn)位,從而動(dòng)員更多的葡萄糖被轉(zhuǎn)運(yùn)至肌細(xì)胞內(nèi)來(lái)刺激糖原合酶的表達(dá)使得機(jī)體骨骼肌中的糖原儲(chǔ)備增加,最終增強(qiáng)機(jī)體的抗疲勞能力。另外,我們收集了100例普通人群和46例慢性疲勞綜合癥病人的血樣檢測(cè)ORM 1的含量,發(fā)現(xiàn)疲勞狀態(tài)超過(guò)半年的人群(包括慢性疲勞患者,特發(fā)性慢性疲勞患者和慢性疲勞綜合癥患者)血樣中的ORM 1均顯著增加。另外,我們還發(fā)現(xiàn)雌性大鼠比雄性大鼠更易疲勞可能與雌激素抑制ORM 1的產(chǎn)生有關(guān)。 具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下: 實(shí)驗(yàn)一:疲勞大鼠肝臟組織差異表達(dá)蛋白的尋找以及驗(yàn)證 利用DIGE實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái),比較分析疲勞大鼠和正常大鼠肝臟差異蛋白的表達(dá)。結(jié)果有11個(gè)差異蛋白點(diǎn)得到串聯(lián)質(zhì)譜的鑒定。其中,alpha-酸性糖蛋白(alpha-1 acid glycoprotein,ORM 1)在疲勞大鼠肝臟中顯著增加。這一結(jié)果在隨后的Western Blot實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證。 實(shí)驗(yàn)二:ORM 1與疲勞的關(guān)系 為了進(jìn)一步研究血清ORM 1的含量與疲勞之間的關(guān)系,我們引入了運(yùn)動(dòng)力竭疲勞模型(簡(jiǎn)稱為力竭組)和經(jīng)典疲勞模型(疲勞組),檢測(cè)了兩組肝臟,骨骼肌和血清中ORM 1的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在疲勞組大鼠中,其肝臟,血清和骨骼肌中的ORM 1的水平都顯著增加,而在力竭組大鼠中只有血清和肌肉中的ORM 1含量增加。此外,為了明確疲勞的嚴(yán)重程度與血清ORM 1的含量之間的聯(lián)系,我們檢測(cè)了經(jīng)典疲勞模型大鼠在疲勞1天,3天,5天,疲勞5天后加休息1天和疲勞后5天加休息3天的血清ORM 1含量,發(fā)現(xiàn)隨著疲勞程度的逐漸加重,其血清中ORM 1的水平亦相應(yīng)增高,而當(dāng)疲勞大鼠經(jīng)過(guò)休息恢復(fù)以后,其血清中ORM 1的含量亦逐漸回復(fù)到正常水平。 實(shí)驗(yàn)三:ORM 1在疲勞中的功能研究 為了進(jìn)一步明確ORM 1在疲勞中所發(fā)揮的作用究竟是具有某種生物學(xué)功能還是僅僅只是一個(gè)標(biāo)志物,我們通過(guò)給C57小鼠注射純品ORM 1,發(fā)現(xiàn)小鼠游泳時(shí)間顯著延長(zhǎng)。與此同時(shí),當(dāng)疲勞的小鼠不能正常產(chǎn)生ORM 1(siRNA in-vivo)時(shí)會(huì)表現(xiàn)得更易疲勞(與單純疲勞的小鼠相比,其游泳時(shí)間顯著縮短。) 實(shí)驗(yàn)四:大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素通過(guò)誘導(dǎo)ORM 1的表達(dá)發(fā)揮抗疲勞活性 依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo),選用不同劑量的紅霉素來(lái)誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)ORM 1的表達(dá)并同時(shí)檢測(cè)其相應(yīng)的游泳時(shí)間。結(jié)果發(fā)現(xiàn),紅霉素可以劑量依賴性地上調(diào)小鼠血清ORM 1的水平,同時(shí)劑量依賴性地延長(zhǎng)小鼠的游泳時(shí)間。在對(duì)紅霉素治療小鼠的同時(shí)干擾ORM 1的合成后,紅霉素延長(zhǎng)小鼠游泳時(shí)間的效應(yīng)則被大大抵消。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的其他抗生素例如克拉霉素和阿奇霉素也具有相類(lèi)似的效果。另外,在對(duì)紅霉素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后發(fā)現(xiàn),其抗菌活性基團(tuán)對(duì)于其發(fā)揮抗疲勞效應(yīng)不是必須的。 實(shí)驗(yàn)五:ORM 1抗疲勞的機(jī)制研究 ORM 1可以上調(diào)骨骼肌p-AMPK的表達(dá),促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4(Glucose Transporter 4, GLUT4)從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜來(lái)發(fā)揮葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)移,最終通過(guò)活化糖原合酶來(lái)增加細(xì)胞中的糖原儲(chǔ)備。在疲勞組和紅霉素組中,ORM 1刺激GLUT 4從胞漿轉(zhuǎn)位到胞膜(膜GLUT 4的表達(dá)增加),使得糖原合酶的活性形式非磷酸化的糖原合酶表達(dá)增加,從而使得糖原的合成相應(yīng)增加。這一效應(yīng)在AMPK-α敲除的小鼠中消失,盡管紅霉素依舊能誘導(dǎo)ORM 1的表達(dá)增加,但是后續(xù)的GLUT 4轉(zhuǎn)位以及最終的糖原儲(chǔ)備增加效應(yīng)已經(jīng)被明顯削弱。 實(shí)驗(yàn)六ORM 1在人群中的研究 我們?cè)谌巳褐型ㄟ^(guò)發(fā)放疲勞問(wèn)卷的方式來(lái)對(duì)人群的疲勞程度進(jìn)行分級(jí):對(duì)照,輕度疲勞,疲勞,慢性疲勞,特發(fā)性慢性疲勞和慢性疲勞綜合癥(排序從輕到重)。在所選取的100例人群中,有38例被納入不疲勞組,22例納入輕度疲勞組,18例納入疲勞組,9例納入慢性疲勞組,13例納入特發(fā)性慢性疲勞組(其中有7例血清ORM 1含量高于人群的ORM 1參考值上限:1 mg/ml)。沒(méi)有個(gè)體符合慢性疲勞綜合癥的診斷。隨后我們檢測(cè)了上述所有個(gè)體的血清ORM 1的含量,發(fā)現(xiàn)在疲勞狀態(tài)超過(guò)半年以上的慢性疲勞組和特發(fā)性慢性疲勞組中其血清ORM 1的水平要顯著性地高于對(duì)照組。另外,對(duì)納入研究的慢性疲勞綜合癥的46例患者進(jìn)行血清ORM 1檢測(cè),亦同樣發(fā)現(xiàn)ORM 1顯著性地升高。 實(shí)驗(yàn)七:疲勞的性別差異與雌激素抑制ORM 1的產(chǎn)生有關(guān) 我們發(fā)現(xiàn)雌性大鼠的游泳時(shí)間要顯著少于雄性大鼠。而去卵巢的雌性大鼠的游泳時(shí)間要顯著性地長(zhǎng)于假手術(shù)組,在對(duì)去卵巢大鼠給予雌激素治療以后,其游泳時(shí)間與假手術(shù)大鼠組沒(méi)有差異。隨后我們檢測(cè)了雌雄大鼠在疲勞狀態(tài)下肝臟ORM 1的含量,發(fā)現(xiàn)在同樣的疲勞狀態(tài)下,雌性大鼠所產(chǎn)生的ORM 1要顯著性地少于雄性大鼠。在對(duì)去卵巢大鼠和假手術(shù)組的大鼠肝臟ORM 1的含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí),發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠肝臟能產(chǎn)生更多的ORM 1。隨后我們分別測(cè)定了雌激素受體α和β敲除的小鼠的游泳時(shí)間,發(fā)現(xiàn)同野生型相比,在雌激素受體被敲除以后其游泳時(shí)間的性別差異消失。提示我們疲勞的性別差異可能與雌激素抑制ORM 1的產(chǎn)生有關(guān)。 結(jié)論: 1. ORM 1是一種內(nèi)源性的抗疲勞蛋白; 2. ORM 1可能作為慢性疲勞綜合癥的診斷標(biāo)志物; 3.疲勞的性別差異可能與疲勞時(shí)雌激素對(duì)ORM 1的產(chǎn)生抑制有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R363

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2262178