【摘要】：PIAS(protein inhibitor of activated STAT)蛋白家族是一種能夠激活STAT轉(zhuǎn)錄活性的抑制蛋白,共包括四個(gè)成員：PIAS1、PIAS2、PIAS3和PIASy。其中PIAS2包括PIASxa和PIASxβ兩種亞型,兩者均特異表達(dá)于人睪丸組織中,但目前其在精子發(fā)生過(guò)程中的作用機(jī)制尚未闡明。為此,本課題通過(guò)研究PIAS2與其相互作用蛋白R(shí)ACK1的相互作用機(jī)制,以揭示其在精子發(fā)生中的作用機(jī)制。 在前期工作中,通過(guò)酵母雙雜交技術(shù),從小鼠精原細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選了與PIAS2相互作用的多種蛋白,其中GNB2L1,即RACK1蛋白,是一個(gè)新的相互作用蛋白。RACK1蛋白是有活性的激酶C受體的簡(jiǎn)稱,是一種多功能的支架蛋白,其結(jié)構(gòu)中包含七個(gè)WD40的重復(fù)序列,研究發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域能與多種激酶及膜受體等相互作用而發(fā)揮其功能。本研究通過(guò)如下四個(gè)方面對(duì)PIAS2與RACK1相互作用的機(jī)制進(jìn)行了研究。 第一,通過(guò)直接酵母雙雜交實(shí)驗(yàn),證實(shí)了在酵母細(xì)胞中PIAS2可以與篩選出的兩個(gè)RACK1獨(dú)立克隆相互作用。 將pGBKT7-PIAS2分別與捕獲質(zhì)粒pGADT7-RACK1(123-317aa)和pGADT7-RACK1(136-317aa)共轉(zhuǎn)染至酵母細(xì)胞AH109中,應(yīng)用SD/-LTHA/X-a-Gal進(jìn)行報(bào)告基因的檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩個(gè)RACK1獨(dú)立克隆與PIAS2共轉(zhuǎn)染組均能在營(yíng)養(yǎng)缺陷的培養(yǎng)基上生長(zhǎng),并激活laz報(bào)告基因,呈現(xiàn)藍(lán)色。表明酵母細(xì)胞中PIAS2與RACK1能夠相互作用。 第二,分別應(yīng)用免疫共沉淀和細(xì)胞共定位分析確定PIAS2和RACK1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能夠相互作用。 首先,由于HeLa細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)PIAS2和RACK1蛋白,因此,我們?cè)贖eLa細(xì)胞總蛋白中分別用鼠抗PIAS2抗體及兔抗RACK1抗體進(jìn)行了免疫共沉淀,然后分別用兔抗RACK1抗體及鼠抗PIAS2抗體進(jìn)行Western Blot分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在鼠抗PIAS2抗體的共沉淀產(chǎn)物中能夠檢測(cè)到RACK1蛋白,而兔抗RACK1抗體的共沉淀產(chǎn)物中也能檢測(cè)到PIAS2蛋白,表明PIAS2與RACK1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能夠相互作用。 其次,通過(guò)細(xì)胞共定位確定兩者在細(xì)胞中能夠相互作用。將真核表達(dá)質(zhì)粒pCS-Myc-PIAS2轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中,48小時(shí)后,用鼠抗c-myc抗體和兔抗RACK1多克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),PIAS2和RACK1蛋白共定位于HeLa細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。同時(shí),我們還分別構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pDsRed-Express-1-PIAS2和pEGFP-RACK1,將兩者共轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中,48小時(shí)后用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察,結(jié)果顯示：pDsRed-PIAS2的紅色熒光融合蛋白與pEGFP-RACKl的綠色熒光融合蛋白部分共定位于HeLa細(xì)胞中。上述結(jié)果提示,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中PIAS2與RACK1能夠共定位于細(xì)胞中,因而具有相互作用的可能。 第三,通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)確定了PIAS2與RACK1相互作用的最小區(qū)域。 根據(jù)RACK1全長(zhǎng)序列,構(gòu)建包含了WD3-WD7、WD4-WD7、WD5-WD7、WD6-WD7、 WD7、WD1-WD4、WD1-WD5、WD1-WD6在內(nèi)共8種長(zhǎng)短不等的pGADT7重組質(zhì)粒,分別與pGBKT7-PIAS2進(jìn)行直接酵母雙雜交分析,并在SD/-LTHA/X-α-Gal培養(yǎng)基上進(jìn)行報(bào)告基因的分析,從而確定了RACK1蛋白中與PIAS2蛋白相互作用的關(guān)鍵區(qū)域：WD5-WD7重復(fù)結(jié)構(gòu)域。 根據(jù)PIAS2蛋白的結(jié)構(gòu)域組成,構(gòu)建了包含mPIAS2(9-242aa)、mPIAS2(9-345aa)、 mPIAS2(243-401aa)、mPIAS2(346-401aa)片段的pGBKT7的重組質(zhì)粒,分別與pGADT7-RACK1(WD5-WD7)進(jìn)行直接酵母雙雜交實(shí)驗(yàn),并在SD/-LTHA/X-α-Gal上進(jìn)行報(bào)告基因的檢測(cè),結(jié)果顯示,第9-242氨基酸(SAP結(jié)構(gòu)域)和第243-401氨基酸(PINIT和RLD結(jié)構(gòu)域)與RACK1蛋白WD5-WD7結(jié)構(gòu)域相互作用很微弱；PIAS2中第346-401氨基酸(RLD結(jié)構(gòu)域)和第9-345氨基酸(SAP和PINIT結(jié)構(gòu)域)與RACK1蛋白WD5-WD7結(jié)構(gòu)域具有很強(qiáng)的相互作用,表明,PIAS2蛋白中有多個(gè)與RACK1相互作用的區(qū)域。 第四,通過(guò)SUMO化修飾分析及過(guò)表達(dá)細(xì)胞系研究?jī)煞N蛋白相互作用的意義。 據(jù)報(bào)道,PIAS2可以通過(guò)SUMO化修飾的方式來(lái)調(diào)控其相互作用的蛋白,同時(shí),應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)RACK1蛋白中含有一個(gè)典型的SUMO化位點(diǎn)。因此,我們推測(cè)PIAS2有可能通過(guò)SUMO化修飾RACK1來(lái)調(diào)控其功能。將pCS-myc-PIAS2(9-401aa)、 pEGFP-PIASxa、pEGFP-PIASxβ分別與pEGFP-UBC9和pEGFP-SUMOI組合瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,24小時(shí)后收集細(xì)胞,提取蛋白,用抗RACK1抗體及抗SUMO1抗體進(jìn)行Western Blot分析,檢測(cè)RACK1的SUMO化情況：將pCS-Myc-PIAS2、pEGFP-PIASxα、pEGFP-PIASxp分別與pEGFP-UBC9和pEGFP-SUMO2組合瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,用抗RACK1抗體及抗SUMO2抗體進(jìn)行Western Blot分析,檢測(cè)RACK1的SUMO化情況,兩者共同判斷PIAS2是否能夠使RACK1發(fā)生SUMO化。結(jié)果顯示,RACK1并沒(méi)有發(fā)生SUMO化修飾,表明PIAS2可能不能對(duì)RACK1進(jìn)行SUMO修飾,因此,PIAS2可能不是通過(guò)SUMO化修飾RACK1的方式調(diào)控其功能。 為進(jìn)一步探討PIAS2與RACK1相互作用的意義,我們應(yīng)用慢病毒系統(tǒng),構(gòu)建并包裝了PIAS2過(guò)表達(dá)慢病毒,并將其感染小鼠精母細(xì)胞系spd-GC2細(xì)胞,獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)PIAS2的GC2細(xì)胞系,觀察PIAS2過(guò)表達(dá)細(xì)胞系對(duì)RACK1表達(dá)的影響。通過(guò)定量Western Blot分析發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)PIAS2蛋白對(duì)RACK1蛋白的表達(dá)量沒(méi)有顯著的影響。 綜上所述,我們的研究顯示,PIAS2與RACK1蛋白不僅能在酵母細(xì)胞中相互作用,也能在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中相互作用。RACK1中與PIAS2相互作用的關(guān)鍵區(qū)域?yàn)镽ACK1的WD5-WD7結(jié)構(gòu)域,而PIAS2有多個(gè)結(jié)構(gòu)域能夠與RACK1相互作用。同時(shí),我們的研究還發(fā)現(xiàn)PIAS2可能不是通過(guò)SUMO化修飾RACK1調(diào)控其功能,過(guò)表達(dá)PIAS2蛋白對(duì)RACK1的表達(dá)也沒(méi)有明顯的影響,PIAS2與RACK1蛋白相互作用的意義還有待進(jìn)一步研究。
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【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R321.1

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2257870