【摘要】：目的 1、用免疫抑制劑CsA處理BALB/c小鼠，抑制小鼠的免疫功能。再以這些動物為對象，尾靜脈高壓水注射pAAV/HBV1.2質(zhì)粒，監(jiān)測小鼠的病毒血癥、抗原血癥和抗體反應(yīng)，探討免疫抑制劑CsA對HBV復(fù)制過程的影響。 2、觀察CsA不同處理時間對HBV復(fù)制小鼠的病毒復(fù)制和抗原表達的影響；同時檢測各組小鼠天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)，探討免疫抑制影響HBV復(fù)制的機制。 3、用CsA長期處理建立HBV慢性復(fù)制的BALB/c小鼠模型，在停止CsA處理后分別對HBV復(fù)制慢性化的小鼠予以主動免疫和被動免疫，探討免疫調(diào)節(jié)對免疫抑制狀態(tài)下HBV持續(xù)復(fù)制的影響。 材料和方法 1、6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，購自湖北省疾病控制中心。 2、分別用NS或CsA處理BALB/c小鼠，用質(zhì)粒pAAV/HBV1.2經(jīng)尾靜脈高壓水注射小鼠，建立HBV復(fù)制的小鼠模型。定期采集小鼠血液樣本，ECLIA檢測血清內(nèi)HBsAg、HBsAb、HBcAb的水平，同時抽提血清內(nèi)的HBV DNA，Real-Time PCR檢測血清內(nèi)的病毒滴度。分析CsA處理對HBV復(fù)制過程的影響。 3、將BALB/c小鼠分為CsA短期處理（-1至4周）組、CsA持續(xù)處理（-1至10周）組以及生理鹽水處理組，在不同的時間點采集血液樣本或處死小鼠，Elispot檢測小鼠脾臟分泌IFN-γ的HBcAg特異性T細胞頻率。Real-Time PCR檢測小鼠肝組織和脾組織內(nèi)CD分子和抗病毒相關(guān)的細胞因子的mRNA水平。Southern Blot檢測肝內(nèi)HBV的復(fù)制中間體。免疫組化檢測肝組織內(nèi)HBcAg的表達水平。分析CsA處理延長HBV復(fù)制的免疫學(xué)機制。 4、用CsA處理BALB/c小鼠（-1至10周），在0周尾靜脈高壓水注射質(zhì)粒pAAV/HBV1.2建立HBV復(fù)制的小鼠模型。在終止CsA處理后2周后分別給予小鼠PBS、重組乙肝疫苗、未免疫小鼠脾細胞過繼免疫和特異性免疫小鼠脾細胞過繼免疫處理，探討免疫調(diào)節(jié)對免疫抑制狀態(tài)下HBV持續(xù)復(fù)制的影響。 結(jié)果 1、將質(zhì)粒pAAV/HBV1.2通過尾靜脈高壓水注射到BALB/c小鼠體內(nèi)，能使小鼠產(chǎn)生較高的抗原血癥和病毒血癥。NS處理組7周內(nèi)HBsAg被清除。CsA處理組在CsA處理期間抗原血癥和病毒血癥均維持在較高的水平。用CsA處理11周（-1至10周），能使75%的動物HBsAg的持續(xù)陽性超過6個月。 2、隨著CsA處理時間的延長，小鼠HBsAg的表達持續(xù)時間也相應(yīng)延長。CsA處理7周（-1至6周），能使大部分動物HBsAg持續(xù)陽性達6個月以上。 3、CsA持續(xù)處理不能抑制小鼠特異性T細胞的產(chǎn)生。相反，CsA處理組特異性T細胞反應(yīng)較NS處理組明顯增強。 4、CsA處理能抑制某些CD分子和細胞因子在肝組織和脾組織內(nèi)的表達，包括CD3、CD4、CD8、FasL、Perforin、IL-2。但是對IFN-γ、TNF-α和IFN-β的表達卻沒有影響。CsA短期處理后，HBV感染清除，部分細胞因子的表達呈反彈上升趨勢。 5、停止CsA處理的慢性HBV復(fù)制小鼠中，重組乙肝疫苗治療能促進HBV的清除，并促進HBsAb和HBcAb的產(chǎn)生，增強小鼠特異性T細胞應(yīng)答。 6、停止CsA處理的慢性HBV復(fù)制小鼠中，特異性免疫小鼠脾細胞過繼免疫和未免疫小鼠脾細胞過繼免疫均能控制HBV的復(fù)制，其中特異性免疫小鼠脾細胞過繼免疫的作用尤為明顯，并能促進HBcAb的產(chǎn)生和增強小鼠特異性T細胞應(yīng)答。 結(jié)論 1、在高壓水注射小鼠模型中，用CsA處理BALB/c小鼠能改變HBV復(fù)制持續(xù)的時間。CsA持續(xù)處理7周（-1至6周）可有效延長HBV的復(fù)制時間至6個月以上。 2、CsA處理對特異性T細胞的產(chǎn)生，以及相應(yīng)細胞IFN-γ和TNF-α的表達和分泌無明細影響，但是對Perforin和Fas-L等免疫分子表達有抑制作用，與HBV的持續(xù)復(fù)制有關(guān)。這提示HBV的清除需要機體具備完整的免疫功能，功能缺失的特異性T細胞不足以清除HBV感染。 3、隨著CsA處理的終止，CsA短期處理的小鼠體內(nèi)HBV的復(fù)制可被清除，，肝內(nèi)和脾內(nèi)多種CD分子和細胞因子的表達水平反彈上升，特異性T細胞分泌IFN-γ的能力也增強，提示短期免疫抑制劑處理后機體的免疫功能可逐漸恢復(fù)并控制HBV的復(fù)制。 4、在停止CsA處理的HBV持續(xù)性復(fù)制小鼠中，重組乙肝疫苗免疫或特異性脾細胞過繼免疫能有效清除或控制HBV的復(fù)制，促進小鼠體液免疫應(yīng)答的恢復(fù)，增強特異性T細胞免疫應(yīng)答。 本研究的創(chuàng)新點 1、以高壓水注射的急性HBV復(fù)制小鼠模型為背景，利用免疫抑制劑處理BALB/c小鼠，導(dǎo)致HBV的持續(xù)復(fù)制。并初步闡述了CsA對宿主免疫功能的抑制作用，以及對延長HBV復(fù)制的可能免疫學(xué)機制。 2、利用CsA處理的HBV持續(xù)性復(fù)制小鼠模型，探討免疫調(diào)節(jié)治療在控制HBV感染中的作用。重組乙肝疫苗主動免疫或特異性脾細胞過繼免疫能清除后有效控制HBV的復(fù)制，促進體液免疫應(yīng)答的恢復(fù)，并促進特異性T細胞應(yīng)答的增強，提示免疫調(diào)節(jié)可用于治療免疫抑制劑誘導(dǎo)的慢性HBV感染。 本研究的意義 通過免疫抑制劑CsA調(diào)控小鼠的免疫功能，延長HBV在BALB/c小鼠中的復(fù)制，并研究CsA處理對機體免疫功能的影響，為理解免疫抑制狀態(tài)下慢性HBV感染的免疫學(xué)機制提供新的見解。另外，利用主動免疫或被動免疫治療慢性HBV復(fù)制小鼠，研究免疫調(diào)節(jié)對免疫抑制狀態(tài)下HBV持續(xù)復(fù)制的影響，為免疫調(diào)節(jié)用于治療免疫抑制劑誘導(dǎo)的慢性HBV感染奠定了實驗和理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:Purpose 1. The BALB/ c mice were treated with immunosuppressive agents to inhibit the immunity of mice. Function. The plasmid pAAV/ HBV1.2 was injected with high-pressure water at the tail vein in these animals, and the virus, antigen and antibody responses of the mice were monitored, and the replication process of HBV was discussed. The effects of different treatment times on viral replication and antigen expression of HBV-replicating mice were observed. A BALB/ c mouse model for chronic HBV replication was established by long-term treatment of HBV, and the mice with chronic HBV replication were immunized with active immunization and passive immunization respectively after stopping the anti-inflammatory treatment, and the immune regulation was discussed. V Continuous Replication Effects of materials and methods 1, 6-8 weeks old female BALB/ c BALB/ c mice were treated with NS or OVA, and plasmid pAAV/ HBV1.2 was used to treat BALB/ c mice. Mice were injected to establish the mouse model of HBV replication. The blood samples of mice were collected on a regular basis. ECLIA was used to detect the levels of HBsAg, cryAb and cryAb in serum, and the HBV DNA, Real-Time PCR detects the degree of virus drop in the serum. 3. BALB/ c mice were divided into three groups: short-term treatment (-1 to 4 weeks), continuous treatment (-1 to 10 weeks) and saline treatment group, blood samples were collected at different time points or mice were killed, and the spleen of mice was tested by Elispoot. Detection of CD in Mouse Liver Tissues and Splenic Tissues by Real-Time PCR mRNA levels of molecular and antiviral-related cytokines. South Modern Blot tests the replication intermediates of HBV in the liver. Immunohistochemical method was used to detect the level of Ag in liver tissue. The immunological mechanism for prolonging the replication of HBV was analyzed. 4. BALB/ c mice (-1 to 10 weeks) were treated with MEBO. The plasmid was injected with high pressure water at the tail vein of 0 week. pAAV/ HBV1.2 was used to establish the mouse model of HBV replication. After 2 weeks after the end-of-day treatment, mice were treated with PBS, recombinant hepatitis B and non-immunized mouse spleen cells. to get rid of Effect of epidemic regulation on the continuous replication of HBV in immunosuppressed state. Results 1. Plasmid pAAV/ HBV1.2 was injected through tail vein high pressure water. In BALB/ c mice, mice can be produced Higher antigen and viremia. HBsAg was cleared within 7 weeks of the NS treatment group. The treatment group maintained high levels of antigen and viremia during the treatment period. Treatment with palbociclib for 11 weeks (-1 up to 10 weeks), 75% of animal HBsAg can be continuously positive for more than 6 months. With the prolongation of treatment time, the duration of HBsAg expression in mice was prolonged. 7 weeks (-1 to 6 weeks) enabling most of the animals to remain positive for HBsAg Sex for more than 6 months. 3. Continuous treatment cannot inhibit mouse specificity. In contrast, the specific T-cell response in the treated group was significantly higher than that in the NS treatment group. 4. The treatment of T cells inhibited some CD molecules and cytokines in liver and spleen groups. Expression in tissue, including CD3, CD4, CD8, FasL, Perf The expression of orin, IL-2. However, the expression of IFN-jun, TNF-jun and IFN-jun was There was no effect. After short-term treatment, HBV infection was cleared, and some cytokines expression showed a rebound trend. Therapy can promote the clearance of HBV, promote the production of anti-HBV Ab and anti-HBV Ab, enhance the specific T cell response of mice. 6. Stop the treatment of chronic HBV replication in mice, and specifically immunize the spleen cells of the mice. The adoptive immunotherapy of spleen cells of epidemic mice can control the replication of HBV, in which specificity immunity The effect of adoptive immunotherapy on spleen cells in mice is especially obvious, and it can promote the production and enhancement of mouse-specific T cell response. Conclusion 1. BALB/ c mice were treated with MEBO in the model of high pressure water injection. Mice can change HBV replication duration. Continuous treatment for 7 weeks (-1 to 6 weeks) can effectively prolong the replication time of HBV to more than 6 months. There was no detail effect on the expression and secretion of the expression and secretion, but it inhibited the expression of the immune molecules such as Perforin and Fas-L. V is related to continuous replication. This suggests that HBV clearance requires a complete immune function, and the absence of specific T cells is not sufficient to clear the HBV infection. The replication of HBV can be cleared, and the expression level of various CD molecules and cytokines in the liver and spleen rebound. It is suggested that the immune function of the body can gradually recover and control the replication of HBV after the short-term immune inhibitor is treated. group immunity or the adoptive immunotherapy of specific spleen cells can effectively eliminate or control HBV replication, promote the recovery of humoral immune response in mice and enhance the immune response of specific T cells. At the innovation point 1 of the study, the model of acute HBV replication with high pressure water injection was used as the background, and the immune response was used as the background. The inhibitor treated BALB/ c mice, leading to the continuous replication of HBV. Role and possible immunological mechanisms to prolong the replication of HBV. The model of HBV sustained replication in mice was used to explore the role of immunomodulating therapy in controlling HBV infection. can be effective after being cleared To control the replication of HBV, to promote the recovery of humoral immune response, and to promote the enhancement of specific T cell response. It is suggested that immunoregulation can be used to treat the chronic HBV infection induced by immunosuppressive agents. The immune function of mice is prolonged, the replication of HBV in BALB/ c mice is prolonged, and the effect of treatment on the immune function of the body is studied. In order to understand the immune mechanism of chronic HBV infection in immunosuppressed state, new insights are provided.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R512.62;R392

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本文編號：2257912