【摘要】：第一章聚肌胞(PolyⅠ:C)對人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究 第一節(jié)人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞表達(dá)Toll樣受體的研究 目的：分離純化人臍靜脈血來源的單個(gè)核細(xì)胞并誘導(dǎo)培養(yǎng)為內(nèi)皮祖細(xì)胞,觀察Toll樣受體在人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞中的表達(dá)情況。 方法：采用密度梯度離心法分離人臍靜脈血中的單個(gè)核細(xì)胞,用含多種生長因子的內(nèi)皮祖細(xì)胞專用EBM-2培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng),誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞向內(nèi)皮祖細(xì)胞分化,通過形態(tài)學(xué)、免疫熒光及逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測并鑒定細(xì)胞的生物學(xué)特性；采用RT-PCR法檢測靜息狀態(tài)下人內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)表達(dá)的Toll樣受體亞型；檢測不同濃度的PolyⅠ:C對內(nèi)皮祖細(xì)胞表達(dá)TLR3受體、炎性細(xì)胞因子的影響。 結(jié)果： 1.分離培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞早期以集落為中心呈放射狀生長,晚期形成典型的“鋪路石”樣改變。熒光染色示DiL-acLDL和FITC-UEA-I雙染色陽性；RT-PCR法檢測示細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD133、KDR,證明為內(nèi)皮祖細(xì)胞。 2.靜息狀態(tài)下,內(nèi)皮祖細(xì)胞表達(dá)較高水平的TLR1、TLR3、TLR4、TLR6,表達(dá)較低水平的TLR2、TLR5、TLR7、TLR8、TLR10,不表達(dá)TLR9。而PolyⅠ:C能上調(diào)TLR3的mRNA及蛋白表達(dá),并呈量效關(guān)系。 3. PolyⅠ:C通過活化TLR3劑量依賴性上調(diào)炎性細(xì)胞因子IL-1p、IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-p的基因表達(dá)。 結(jié)論：EPCs表達(dá)功能性TLR3；PolyⅠ:C能呈劑量依賴性上調(diào)TLR3在EPCs的mRNA及蛋白表達(dá),并通過活化TLR3劑量依賴性上調(diào)炎性細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)。 第二節(jié)PolyⅠ:C對人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、凋亡的影響 目的：觀察TLR3的配體PolyⅠ:C對人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、凋亡的影響。 方法：采用不同濃度的PolyⅠ:C持續(xù)干預(yù)人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs),通過CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測其對EPCs增殖的影響及時(shí)間效應(yīng)；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度的PolyⅠ:C對EPCs細(xì)胞周期時(shí)相分布及細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果： 1.與對照組相比,較高濃度PolyⅠ:C(1,10μg/m1)持續(xù)作用于臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞3天后顯著抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖；終濃度10μg/ml的PolyⅠ:C呈時(shí)間依賴性抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖。 2.較高濃度的PolyⅠ:C(1,10μg/m1)顯著減少S期和G2/M期細(xì)胞比例,并通過下調(diào)細(xì)胞周期素A,B1,D1,E的表達(dá)阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期而改變細(xì)胞周期的時(shí)相分布,從而抑制EPCs的增殖。 3. PolyⅠ:C呈劑量依賴性誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡。 結(jié)論：高濃度的PolyⅠ:C通過將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而抑制EPCs增殖。 第三節(jié)PolyⅠ:C誘導(dǎo)人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究 目的：闡明PolyⅠ:C誘導(dǎo)人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制。 方法：利用Caspase8的抑制劑和Caspase9的抑制劑抑制相應(yīng)的信號分子,分析其對PolyⅠ:C誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。以不同濃度的TNF-α及IL-1β干預(yù)EPCs24h后,CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)分別檢測TNF-α和IL-1β對細(xì)胞凋亡的影響。利用IL-1β受體的中和抗體Anti-IL-1R1預(yù)先封閉IL-1β的結(jié)合位點(diǎn),分析其對PolyⅠ:C誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。 結(jié)果： 1. Caspase8和9的抑制劑并不能抑制PolyⅠ:C誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。 2.隨著TNF-α作用濃度的增高,EPCs的細(xì)胞凋亡率并無明顯增加。 3.隨著IL-1p作用濃度的增高,EPCs的細(xì)胞凋亡率逐步增加,并呈劑量依賴性。使用IL-1p受體的中和抗體Anti-IL-1R1預(yù)先封閉IL-1p的結(jié)合位點(diǎn)后,再加入PolyⅠ:C干預(yù)24h,結(jié)果顯示高濃度的Anti-IL-1R1可以部分抑制PolyⅠ:C誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。 結(jié)論：PolyⅠ:C活化TLR3后通過上調(diào)IL-1p的表達(dá)誘導(dǎo)EPCs凋亡,而內(nèi)、外源性細(xì)胞凋亡途徑及TNF-a不參與PolyⅠ:C誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 第二章Pam3CSK4在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)非耐受性的細(xì)胞因子表達(dá) 第一節(jié)Pam3CSK4對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)炎癥因子的影響及其可能機(jī)制 目的：闡明TLR1/2激動劑Pam3CSK4對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)炎癥因子的影響及其可能機(jī)制。 方法：以不同濃度的Pam3CSK4干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs), RT-PCR法檢測Pam3CSK4對TLR1、TLR2mRNA表達(dá)的影響。用RT-PCR法、Real-time RT-PCR法、ELISA法檢測Pam3CSK4對HUVECs分泌TNF-α、IL-6的時(shí)間效應(yīng)及劑量效應(yīng)。分別用TLR1、TLR2及TLR1阻斷劑阻斷相應(yīng)受體的表達(dá),觀察其對Pam3CSK4誘導(dǎo)HUVECs分泌TNF-α、IL-6的影響。用Western-blot法檢測Pam3CSK4對MAPK家族及NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化情況。 結(jié)果：Pam3CSK4呈劑量依賴性上調(diào)TLR2的mRNA表達(dá),而對TLR1mRNA表達(dá)的影響不明顯。Pam3CSK4呈劑量依賴性上調(diào)TNF-α、IL-6的基因及蛋白表達(dá)量。加入TLR1、TLR2、TLR1/2受體阻斷劑后均能明顯抑制Pam3CSK4誘導(dǎo)的TNF-a、IL-6的基因表達(dá)上調(diào),其中以TLR1/2受體阻斷劑的阻斷作用最明顯。Pam3CSK4與TLR2結(jié)合后可以不同程度活化MAPK家族和NF-κB信號傳導(dǎo)通路。 結(jié)論：HUVECs表達(dá)功能性TLR2；Pam3CSK4與TLR2結(jié)合后活化MAPK家族和NF-κB信號傳導(dǎo)通路,從而誘導(dǎo)炎癥因子TNF-α、IL-6的分泌,且TNF-α、IL-6的分泌依賴于TLR1及TLR2的表達(dá)。 第二節(jié)Pam3CSK4在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)非耐受性的IL-6表達(dá) 目的：闡明預(yù)處理的TLR1/2激動劑Pam3CSK4重復(fù)刺激對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)炎癥因子的影響及其可能機(jī)制。 方法：以不同濃度的Pam3CSK4預(yù)處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)后,再用Pam3CSK4重復(fù)刺激HUVECs,用RT-PCR法、Real-time RT-PCR法、ELISA法檢測Pam3CSK4對HUVECs分泌TNF-α、IL-6的影響。用不同TLR受體的配體預(yù)處理HUVECs后,再用Pam3CSK4重復(fù)刺激HUVECs,以觀察不同TLR受體之間的耐受情況。Western-blot法檢測Pam3CSK4重復(fù)刺激對MAPK家族及NF-κB信號傳導(dǎo)通路的活化情況。RT-PCR法檢測Pam3CSK4對負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白鋅指蛋白A20基因表達(dá)的影響,然后用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試驗(yàn)檢測A20的過度表達(dá)對Pam3CSK4及LPS誘導(dǎo)的IL-6分泌的影響。用Notch信號通路抑制劑抑制相關(guān)分子,觀察其對Pam3CSK4誘導(dǎo)HUVECs分泌IL-6的影響。 結(jié)果：給予HUVECsPam3CSK4預(yù)處理后,再給予Pam3CSK4重復(fù)刺激可以下調(diào)TNF-a的基因及蛋白表達(dá),而對IL-6表達(dá)無影響。LPS預(yù)處理可以使Pam3CSK4誘導(dǎo)的TNF-α表達(dá)下降,而對IL-6表達(dá)無影響。Pam3CSK4重復(fù)刺激HUVECs能抑制JNK通路的活化,而對p38、ERK、NF-κB信號通路的活化無影響。Pam3CSK4呈劑量依賴性上調(diào)負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白鋅指蛋白A20的基因表達(dá),A20的過度表達(dá)對Pam3CSK4及LPS誘導(dǎo)的IL-6分泌無明顯影。Notch信號通路抑制劑能部分抑制Pam3CSK4誘導(dǎo)的IL-6分泌。 結(jié)論： 1.Pam3CSK4重復(fù)刺激可誘導(dǎo)耐受性的TNF-α表達(dá),而誘導(dǎo)非耐受性的IL-6表達(dá)。 2.TLR2與TLR4之間存在交叉耐受性。 3.Pam3CSK4可能通過Notch信號通路誘導(dǎo)非耐受性的IL-6表達(dá)。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 吳麗娟;劉國棟;陳偉;蔣建新;朱佩芳;;鋅指蛋白A20對人單核細(xì)胞LPS應(yīng)答的影響[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2007年14期

2 崔新華;王z牖，

本文編號：2252372