【摘要】：目的:體外合成X連鎖調(diào)亡抑制蛋白(XIAP)基因編碼區(qū)序列,將其插入空載體pTAT-HA質(zhì)粒,構(gòu)建pTAT-XIAP原核表達載體,獲得高產(chǎn)量、高純度的TAT-XIAP目的蛋白,蛋白復(fù)性后并研究融合蛋白TAT-XIAP的生物學(xué)活性。方法:體外合成大鼠XIAP基因編碼區(qū)序列,將其插入pTAT-HA質(zhì)粒,構(gòu)建重組表達載體pTAT-XIAP,Nco I和Xho I酶對pTAT-XIAP質(zhì)粒DNA進行雙酶切并測序無誤后,將pTAT-XIAP重組表達載體轉(zhuǎn)入大腸埃希氏菌(E.coli)表達菌株BL21plysS。隨機挑取陽性克隆的單菌落,接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)過夜,當(dāng)OD600=0.8-1時,加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度1mM,誘導(dǎo)4h,聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)顯示目的蛋白主要以包涵體的形式存在。進一步優(yōu)化表達條件,SDS-PAGE及蛋白印跡法(western blot)鑒定目的蛋白TAT-XIAP的表達形式。取TAT-XIAP包涵體蛋白溶解于8M尿素4℃過夜,離心取上清加入鎳離子親和層析柱(Ni2+-NTA),在變性的條件下,用20mM和50mM咪唑溶液各15mL進行洗脫,100mM咪唑溶液收集純化的TAT-XIAP目的蛋白。SDS-PAGE鑒定該蛋白的純化效果。將純化后的TAT-XIAP蛋白、10%甘油和0.014mol/L的β-巰基乙醇裝入透析袋,依次用6M、5M、4M、2M、1M尿素緩沖液和PBS 4℃磁力攪拌進行透析,獲得了復(fù)性的TAT-XIAP融合蛋白。取CEN2對數(shù)生長期的細胞,不同濃度的融合蛋白TAT-XIAP作用不同時間,MTT法檢測TAT-XIAP融合蛋白對CEN2細胞生長的影響。SD大鼠腹腔注射復(fù)性后的TAT-XIAP融合蛋白,于注射12h后斷頭取大腦組織,冰凍切片,厚約6μm,免疫熒光顯微鏡下觀察TAT-XIAP融合蛋白在腦組織的分布情況。結(jié)果:1.1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示pTAT-XIAP質(zhì)粒DNA約4.5kb,pTAT-HA質(zhì)粒DNA約3kb。pTAT-XIAP質(zhì)粒DNA經(jīng)NcoI/XhoI酶切鑒定,電泳結(jié)果顯示在Marker約3kb處可見空載體pTAT-HA的條帶,在Marker約1.5kb處可見XIAP的條帶。2.12%SDS-PAGE結(jié)果顯示TAT-XIAP目的蛋白分子量約64kD,該蛋白主要以包涵體的形式存在,經(jīng)調(diào)整誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度及誘導(dǎo)時間等進一步優(yōu)化誘導(dǎo)條件,發(fā)現(xiàn)TAT-XIAP目的蛋白仍主要以包涵體的形式存在。TAT-XIAP目的蛋白在變性條件下經(jīng)鎳離子親和層析柱純化,獲得了高產(chǎn)量、高純度的TAT-XIAP目的蛋白。TAT-XIAP融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE和western blot分析,在分子量約64kD處有一明顯表達條帶,實驗結(jié)果與理論結(jié)果相符。3.蛋白復(fù)性后,MTT法檢測TAT-XIAP融合蛋白對CEN2細胞生長的影響,數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析后,結(jié)果顯示TAT-XIAP融合蛋白對CEN2細胞的生長有促進作用。4.免疫熒光結(jié)果顯示SD大鼠腦組織中有大量綠色熒光信號,其中以大腦皮質(zhì)、基底節(jié)處多見。該蛋白主要分布在細胞漿中。PBS對照組除非特異性著色外,未見明顯陽性綠色熒光信號。結(jié)論:1.成功構(gòu)建pTAT-XIAP原核表達載體并表達出目的蛋白。2.重組蛋白TAT-XIAP經(jīng)鎳離子親和層析純化,獲得了高產(chǎn)量、高純度的目的蛋白。3.重組蛋白TAT-XIAP復(fù)性成功,動物實驗證實該蛋白可成功穿透血腦屏障,MTT法檢測發(fā)現(xiàn)TAT-XIAP融合蛋白對CEN2細胞生長有促進作用,其作用機制有待進一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R363

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本文編號：2252078