【摘要】：第一部分 HUVEC鈣儲池排空后STIM1的轉(zhuǎn)位變化及其在核鈣信號中的作用 實(shí)驗(yàn)背景 Store-operatedCa2+(SOC)在細(xì)胞生理活動中充當(dāng)著非常重要的作用,其控制著許多功能,如細(xì)胞內(nèi)鈣庫的充盈、酶的激活、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞因子的釋放等等。但是關(guān)于SOC通道的分子結(jié)構(gòu)、蛋白組成以及其調(diào)控機(jī)制一直都未知,直至近幾年大量研究表明STIM1及Orail共同參與SOC通道的開放。 STIM1最先是由于其腫瘤抑制作用被人們所關(guān)注,其在人免疫缺陷病及多類腫瘤中都有著重要作用,直到2005年Jack Roos小組發(fā)現(xiàn),STIM1在哺乳類動物SOC通道中起到重要的作用。STIM1是一種存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的跨膜蛋白,其含有幾個(gè)保守且重要的結(jié)構(gòu)域：位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的EF-hand及sterile a motif(SAM),從蠕蟲到蝶類再到人類EF-hand和SAM都是很保守的結(jié)構(gòu)域；位于胞漿中的卷曲螺旋區(qū)和脯氨酸、賴氨酸富集區(qū)。 STIM1N端的EF-hand位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)是一鈣離子感受器,可以感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的變化：當(dāng)鈣庫內(nèi)Ca2+充盈時(shí),EF-hand以單聚體的形式存在,該單體有著致密的α螺旋結(jié)構(gòu)；Ca2+排空時(shí),EF-hand的致密螺旋結(jié)構(gòu)減少,促進(jìn)二聚體和低聚物的形成。其它的結(jié)構(gòu)域,如SAM、卷曲螺旋區(qū)和脯氨酸賴氨酸富集區(qū)則在STIM1的轉(zhuǎn)位以及胞膜SOCs通道激活起到至關(guān)重要的作用。 ER通過鈣泵ATP酶來實(shí)現(xiàn)攝取和儲存鈣的功能,TG是鈣泵ATP酶的抑制劑,作用后鈣庫不能攝取并儲存鈣,從而達(dá)到鈣庫排空的目的。當(dāng)ER鈣庫充盈時(shí),STIM1位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的N端EF-Hand與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2+結(jié)合。在TG作用后,ER鈣庫排空時(shí),STIM1EF-Hand與Ca2+解離,STIM1轉(zhuǎn)位于胞膜,其胞漿C端與Orail1結(jié)合暴露出另一SOCs通道不可或缺的CRAC激活域(CRAC activation domain (CAD),也叫SOAR或者OASF), SOCs被激活開放從而導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流,鈣庫重新充盈,STIM1回到靜息結(jié)構(gòu)。這種信號傳遞分為四步：1)感受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+濃度降低,STIM1的EF-hand和Ca2+解離；2)與Ca2+解離后,STIM1迅速形成低聚物；3)S1TM1低聚物的C端指引其向胞膜方向移位；4)轉(zhuǎn)位至胞膜附近的STIM1顆粒與Orail1結(jié)合激活SOC通道。 然而本實(shí)驗(yàn)室卻發(fā)現(xiàn)在HUVEC細(xì)胞中STIM1在TG作用后發(fā)生了向細(xì)胞核膜轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象(見胡亞莉論文)。那么這樣一種向細(xì)胞核膜的轉(zhuǎn)位是否有著其特殊的生理意義呢?比如參與到細(xì)胞核鈣信號的調(diào)控? 而關(guān)于核鈣信號的調(diào)控機(jī)制一直都是爭論不休,一部分人認(rèn)為細(xì)胞核鈣信號主要受胞漿鈣信號調(diào)控,而另一部分人則認(rèn)為其存在著自己獨(dú)立的鈣信號調(diào)控系統(tǒng)。根據(jù)以往的研究我們認(rèn)為細(xì)胞核很可能有著自己獨(dú)立的鈣信號系統(tǒng),那么STIM1是否也參與該調(diào)控過程呢? 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?干擾HUVEC中STIM1表達(dá)后觀察STIM1在細(xì)胞核鈣信號系統(tǒng)中的作用。 實(shí)驗(yàn)方法 在HUVEC中轉(zhuǎn)入STIM1干擾質(zhì)粒后,給予TG作用后,重新給予2mM外鈣后觀察轉(zhuǎn)染組與未處理的細(xì)胞細(xì)胞胞漿及核鈣信號差別。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1, HUVEC轉(zhuǎn)入STIM1干擾質(zhì)粒穩(wěn)定篩選后,細(xì)胞STIM1表達(dá)水平被抑制了(73.4±2.2)%,p0.01；而轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒(98.5±3.6)%和非特異性干擾質(zhì)粒(99.1±5.9)%的細(xì)胞STIM1表達(dá)水平與正常對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2, STIM1干擾組細(xì)胞給予TG(R1)后給予2mM細(xì)胞外鈣(R2)其胞漿R2/R1為0.31±0.03,核R2/R1為0.13±0.006,n=54,；相比較正常對照胞漿R2/R1為1.23±0.06,核R2/R1為1.30±0.10,n=80均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,p0.01,STIM1干擾組的核R2/R1被抑制(89.6±2.5)%,胞漿R2/R1被抑制(76.4±4.3)%兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即核鈣信號抑制更明顯,p0.01。而空質(zhì)粒組胞漿R2/R1為1.36±0.05,核R2/R1為1.28±0.05,n=94。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 1, STIM1在HUVECs中蛋白表達(dá)被抑制后SOCs通道開放引起的鈣內(nèi)流受到抑制。 2, STIM1在HUVECs蛋白表達(dá)被抑制后核鈣信號受到抑制。 本實(shí)驗(yàn)提示：STIM1參與HUVECs SOC通道開放,同時(shí)參與HUVECs核鈣信號調(diào)控 第二部分 HUVEC中STIM1的基因突變后的轉(zhuǎn)位現(xiàn)象,以及其在核鈣信號中的作用 研究背景 本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)HUVECs中STIM1在TG作用后發(fā)生向細(xì)胞核膜轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象,并且其在參與胞漿鈣調(diào)控的同時(shí)參與到細(xì)胞核鈣信號的調(diào)控。而在以往的研究中發(fā)現(xiàn)STIM1在TG作用后發(fā)生向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位并參與細(xì)胞膜SOCs通道的開放。那么是什么原因造成這樣的差異呢?在以往的實(shí)驗(yàn)中SOC或者CRAC通道研究,基因突變,往往作為你一種研究手段還探討某一結(jié)構(gòu)域的功能。如在人嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷綜合征(SCID)T細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn),T細(xì)胞受體或者鈣庫排空均不能引起細(xì)胞膜SOCs通道開放細(xì)胞外鈣內(nèi)流。隨著深入研究發(fā)現(xiàn)SCID病人的T細(xì)胞Oraill發(fā)生了點(diǎn)突變。而也有一些研究表明作為ER鈣感受器的STIM1,其EF-hand的鈣離子結(jié)合序列發(fā)生突變時(shí),由于不能其EF-hand不能與鈣結(jié)合,即使細(xì)胞內(nèi)鈣庫充盈的情況下,STIM1即顆粒樣聚集后向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位,與Oraill一起激活SOCs通道引發(fā)外鈣內(nèi)流。因此我們懷疑是否因?yàn)樵贖UVECs中STIM1發(fā)生了突變從而造成其功能改變。后來本實(shí)驗(yàn)室從HUVECs中發(fā)現(xiàn)了信號肽附近的點(diǎn)突變,于是將突變型STIM1構(gòu)建成質(zhì)粒用于對突變型STIM1的進(jìn)一步研究。另外本實(shí)驗(yàn)室曾有實(shí)驗(yàn)表明(見閻巖論文)在HUVECs中給予TG排空鈣庫后,重新加入細(xì)胞外鈣,加入不同濃度的細(xì)胞外鈣使細(xì)胞胞漿及核內(nèi)鈣信號出現(xiàn)不同程度的升高,遞減的細(xì)胞外鈣伴隨著細(xì)胞胞漿鈣信號的遞減,而當(dāng)給給予低于0.1mM細(xì)胞外鈣時(shí)細(xì)胞核鈣信號不再下降,因此我們相信在HUVECs中存在著自己獨(dú)立的鈣信號系統(tǒng),并且我們將0.1mM細(xì)胞外鈣作為選擇性的研究獨(dú)立核鈣信號。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1,探索野生型及突變型STIM1與胞漿及核鈣的關(guān)系 2,觀察野生型及突變型STIM1在鈣庫排空后的轉(zhuǎn)位現(xiàn)象 3,研究HUVECs野生型及突變型STIM1在核鈣信號中的作用 4,研究HEK293中野生型及突變型STIM1在核鈣信號中的作用 實(shí)驗(yàn)方法 1,通過Realtime PCR半定量三個(gè)供體的野生型及突變型STIM1的表達(dá)量,再將其與同供體的胞漿及核鈣信號(1μM組胺刺激)做線性回歸分析,以探索其兩兩間的關(guān)系。 2,通過過表達(dá)野生型及突變型STIM1后給予TG排空鈣庫觀察其轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。 3,通過過表達(dá)野生型及突變型STIM1、干擾STIM1來研究其在HUVECs核鈣信號中的作用 4,通過過表達(dá)野生型及突變型STIM1、干擾STIM1來研究其在HEK293核鈣信號中的作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1,實(shí)驗(yàn)采用三個(gè)供體HUVECs給予1μM組胺刺激后其胞漿及核鈣濃度峰值與野生型、突變型STIM1做相關(guān)性分析。實(shí)驗(yàn)分為：野生型STIM1三個(gè)供體及標(biāo)準(zhǔn)曲線；突變型STIM1三個(gè)供體及標(biāo)準(zhǔn)曲線；內(nèi)參及標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化后以其中一供體為1,得到的PCR產(chǎn)物野生型STIM1為1、0.67、1.07；對應(yīng)的突變型STIM1為1、1.33、2.44。相應(yīng)供體的鈣濃度峰值胞漿分別為：96.386±3.523,107.139±6.661,142.359±6.840；核鈣濃度峰值分別為：169±9.12,210±20.081,250.915±34.439。野生型STIM1與胞漿鈣相關(guān)系數(shù)為0.328沒有相關(guān)性,p0.05,其與核鈣相關(guān)系數(shù)為0.256沒有相關(guān)性,p0.05；突變型STIM1與胞漿鈣相關(guān)系數(shù)為0.202沒有相關(guān)性,p0.05,突變型STIM1與胞漿鈣相關(guān)系數(shù)為0.636有相關(guān)性,p0.01。 2,實(shí)驗(yàn)設(shè)為：野生型STIM1;突變型STIM1的時(shí)間空白對照(即不給于TG刺激)；突變型STIM1。過表達(dá)野生型及突變型STIM1后的細(xì)胞給予TG作用引起鈣庫排空,STIM1發(fā)生轉(zhuǎn)位現(xiàn)象,可見野生型STIM1在鈣庫鈣濃度發(fā)生變化后發(fā)生向細(xì)胞膜周轉(zhuǎn)位聚集,突變型的空白時(shí)間對照則無明顯的轉(zhuǎn)位現(xiàn)象發(fā)生,而突變型STIM1則在部分向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位聚集的同時(shí)又一部分發(fā)生向細(xì)胞核膜轉(zhuǎn)位聚集。突變型STIM1在細(xì)胞內(nèi)鈣庫鈣濃度發(fā)生變化后,細(xì)胞內(nèi)某一STIM1顆粒隨著時(shí)間的變化由細(xì)胞胞漿向細(xì)胞核膜轉(zhuǎn)位并沿著細(xì)胞膜滑行；突變型STIM1在細(xì)胞內(nèi)鈣庫鈣濃度發(fā)生變化后在細(xì)胞核膜上不同的時(shí)間點(diǎn)有突變型STIM1顆粒轉(zhuǎn)位至此,而時(shí)間對照及野生型STIM1則未觀察到該現(xiàn)象。同樣突變型STIM1的時(shí)間熒光曲線在鈣庫鈣濃度發(fā)生變化時(shí)同一核膜位點(diǎn)的在STIM1轉(zhuǎn)位至此的熒光加強(qiáng),而時(shí)間對照及野生型STIM1的時(shí)間熒光曲線則未觀察到該現(xiàn)象。 3,實(shí)驗(yàn)分為正常對照組、過表達(dá)野生型STIM1組、過表達(dá)突變型STIM1組、STIM1干擾組。正常對照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒,過表達(dá)STIM1正常對照組、過表達(dá)野生型STIM1組、STIM1干擾組經(jīng)Western Blotting分析,以正常對照為100%,各組STIM1蛋白表達(dá)水平依次為正常對照(100±0.674)%、空質(zhì)粒(101.975±1.846)%、野生型STIM1(137±2.063)%、突變型STIM1：133.558±1.375)%、STIM1干擾(73.84±0.536)%。給予TG排空鈣庫后(R1),置換為O.1mM外鈣(R2),反應(yīng)回到基線后置換為2mM外鈣(R3),正常對照組胞漿R2/R1為0.131±0.008,R3/R1為1.498±0.049,核R2/R1為0.148±0.008,R3/R1為1.655±0.05(n=21)；過表達(dá)野生型STIM1組胞漿R2/R1為0.15±0.01相比正常對照增加了(14.6±7.4)%,p0.05無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,R3/R1為2.009±0.05,相比正常對照增加了(34.1±3.5)%,p0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,核R2/R1為0.19±0.011相比正常對照增加了(18.4Q7.2)%,p0.05無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,R3/R1為1.919±0.068相比正常對照增加了(15.4+4)%,p0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且核R3/R1增加大于胞漿,p0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；過表達(dá)突變型STIM1組胞漿R2/R1為0.218±0.013,相比正常對照增加了(73.4±10.4)%,R3/R1為2.069±0.087,相比正常對照增加了(39.1±5.8)%,核R2/R1為0.328±0.02相比正常對照增加了(28.5±14)%,R3/R1為2.54±0.07(n=25)相比正常對照增加了(73.8±04.7)%,p0.01均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且核R2/R1及R3/R1增加均大于胞漿,p0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；STIM1干擾組胞漿R2/R1為0.01±0.004,相比正常對照減少了(93.1±3.4)%,R3/R1為0.353±0.016,相比正常對照減少了(76.4±10.7)%,核R2/R1為0.04±0.03相比正常對照減少了(100±0.02)%,R3/R1為0.141±0.01,相比正常對照減少了(91.5±0.6)%,p0.01均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,核與胞漿R2/R1差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,p0.05,核與胞漿R3/R1有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,p0.01。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 1,突變型STIM1發(fā)生向核膜轉(zhuǎn)位,而野生型STIM1則主要向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位 2,突變型STIM1發(fā)生向核膜轉(zhuǎn)位并參與核鈣信號的調(diào)控 第三部分 HUVEC STIM1所調(diào)節(jié)的核鈣信號引起的轉(zhuǎn)錄以及其基因表達(dá)中的作用 實(shí)驗(yàn)背景 大量研究表明,胞漿與核鈣能明顯調(diào)控基因表達(dá)。據(jù)報(bào)道核鈣激活CREB活性在突出活動所必須的神經(jīng)保護(hù)中起到了很重要的作用。在小鼠海馬神經(jīng)元中,蛋白能夠直接激活轉(zhuǎn)錄因子ATF(轉(zhuǎn)錄激活因子3)。在海馬神經(jīng)元由CREB誘導(dǎo)的ATF3表達(dá)由NMDA受體引起的鈣內(nèi)流觸發(fā),并且該過程核鈣濃度的改變及鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅳ的激活都是必需的。過表達(dá)CREB及激活A(yù)TF1能導(dǎo)致黑色素瘤的進(jìn)程和代謝加快,至少能部分促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活及刺激MMP2(基質(zhì)金屬蛋白酶)的表達(dá)。為了探索HUVECs STIM1相關(guān)的核鈣信號的生物效應(yīng)我們在給予刺激后檢測CREB活性及由核鈣激活CREB途徑MMP2的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1,探討HUVECs中參與核鈣信號調(diào)控的STIM1是否引起核鈣依賴的CREB激活 2,探討HUVECs中參與核鈣信號調(diào)控的STIM1是否能引起CREB依賴的MMP2基因表達(dá)增加 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)分為兩組,每組包括正常對照、空質(zhì)粒、wt-STIM1、mt-STIM1、STIM1干擾、DMSO、CREB抑制劑。給予1μM組胺刺激,第一組為30min,第二組為60min。通過ELISA測量CREB活性,用Realtime PCR半定量MMP2的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1,實(shí)驗(yàn)分為正常對照組、空質(zhì)粒組、野生型STIM1組、突變型STIM1組、STIM1干擾組、DMSO組、CREB抑制劑組。分別給予1μM組胺作用30min和60min。給予30min組胺刺激后以正常對照為1,空質(zhì)粒組為1.083±0.08,野生型STIM1為1.167±0.22,突變型STIM1為1.244±0.144,STIM1干擾組為0.917±0.08,DMSO組為1.1656±0.168,CREB抑制劑組為0.924±0.080,各組活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。給予60min組胺刺激后以正常對照為1,空質(zhì)粒組為0.974±0.03；野生型STIM1為1.128±0.07；突變型STIM1為1.564±0.09,CREB活性高于其他六組,p0.01；STIM1干擾組為0.,615±0.04,CREB活性低于正常對照、空質(zhì)粒、過表達(dá)野生型STIM1、過表達(dá)突變型STIM1、DMSO組,p0.01；DMSO組為0.9±0.05;CREB抑制劑組為0.308±0.04,CREB活性低于其他六組,p0.01。 2,給予1μM組胺作用60min后比較各組MMP2mRNA量。以正常對照為1,空質(zhì)粒組為1.023±0.02；野生型STIM1為1.03±0.03；突變型STIM1為1.233±0.029,其MMP2mRNA大于其他六組,p0.01；STIM1干擾組為0.873±0.015,其mRNA低于正常對照、空質(zhì)粒、野生型STIM1、突變型STIM1、DMSO組,pO.01；DMSO組為1.017±0.019,CREB抑制劑組為0.76±0.03,其MMP2mRNA低于其他六組,p0.01. 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 1,STIM1能通過核鈣信號調(diào)節(jié)CREB活性 2,STIM1能通過核鈣信號調(diào)節(jié)CREB活性從而影響MMP2基因表達(dá)
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號：2194707