【摘要】：目的探討不同電刺激波形對脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs)定向排列和細(xì)胞存活率的影響。方法取5周齡SD大鼠(體質(zhì)量100~150 g)體外分離培養(yǎng)ADSCs。用第3~5代細(xì)胞制備細(xì)胞爬片,放入自制電場生物反應(yīng)器中,分別施以電場強(qiáng)度為1、2、3、4、5、6 V/cm的直流電刺激(分別設(shè)為A1、A2、A3、A4、A5、A6組);電場強(qiáng)度6 V/cm、占空比50%、頻率1 Hz和2 Hz的方波電刺激(分別為B1、B2組);電場強(qiáng)度6 V/cm、脈寬2 ms、頻率1 Hz和2 Hz的雙相脈沖波電刺激(分別為C1、C2組)。對照組(D組)不施加電刺激。采用倒置顯微鏡定時(shí)拍照法觀察ADSCs在電場作用過程中的形態(tài)學(xué)變化,計(jì)算細(xì)胞排列的平均對齊指數(shù)(orientation factor,OF);采用羅丹明-鬼筆環(huán)肽熒光染色分析電場刺激后細(xì)胞的骨架排列;活死染色法分析細(xì)胞存活率;鈣離子熒光染色標(biāo)識電刺激中細(xì)胞內(nèi)鈣離子分布,分析細(xì)胞鈣離子活動功能。結(jié)果 ADSCs對直流電刺激的響應(yīng)與電場強(qiáng)度相關(guān),電場強(qiáng)度越高,形成垂直排列的細(xì)胞越多;各時(shí)間點(diǎn)B1、B2組及C1、C2組均未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞定向排列現(xiàn)象。除A5、A6組平均OF顯著高于D組(P0.05)外,其余各組平均OF與D組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。細(xì)胞骨架染色分析表明,A5、A6組細(xì)胞形成緊密的束狀細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),且趨向于垂直電場矢量方向排列。細(xì)胞活死染色顯示,除A4、A5、A6組細(xì)胞存活率顯著低于D組(P0.05)外,其余各組細(xì)胞存活率與D組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。鈣離子熒光染色顯示,A4、A5、A6組細(xì)胞內(nèi)的鈣離子熒光強(qiáng)度稍高于D組,其余各組細(xì)胞內(nèi)的鈣離子熒光強(qiáng)度與D組比較無顯著差別。結(jié)論直流電場強(qiáng)度5 V/cm和6 V/cm刺激可引起ADSCs定向排列,直流電場強(qiáng)度低于5 V/cm以及方波和雙相脈沖波均未引起細(xì)胞定向排列;電刺激后細(xì)胞存活率與電場強(qiáng)度成負(fù)相關(guān)。
[Abstract]:Objective to investigate the effects of different electrical stimulation waveforms on the orientation and survival rate of adipose mesenchymal stem cells (adipose derived mesenchymal stem cells). Methods ADSCs were isolated from 5 week old SD rats (body weight 100 g) in vitro. Cell climbing tablets were prepared from the 3rd generation cells and put into a self-made electric field bioreactor. The electric field was stimulated with electric field intensity of 1 ~ 2 ~ 3 ~ 3 ~ 4 ~ 4 ~ 5 ~ 5 V/cm (A _ (1) A _ (2) A _ (3) A _ (3) A _ (4) A _ (4) A _ (5) A _ (6) group, electric field intensity 6 V / cm, duty cycle 50, square wave stimulation at 1 Hz and 2 Hz (B _ 1B _ 2 group, respectively), electric field intensity 6 V / cm, pulse width 2 Ms, frequency 1 Hz and frequency 1 Hz, respectively. The electric field intensity was 6 V / cm, pulse width was 2 Ms, frequency 1 Hz and frequency 1 Hz. 2 Hz biphasic pulse wave electrical stimulation (C _ 1 C _ 2 group). The control group (group D) did not apply electrical stimulation. The morphologic changes of ADSCs in the process of electric field action were observed by using inverted microscope, and the orientation factor of cell alignment was calculated, and the cytoskeleton arrangement of the cells stimulated by electric field was analyzed by Rhodamine and Gypanopeptide fluorescence staining. The survival rate of cells was analyzed by live staining, and the intracellular calcium distribution was identified by calcium fluorescence staining, and the function of calcium ion activity was analyzed. Results the response of ADSCs to DC stimulation was related to the electric field intensity. The higher the electric field intensity was, the more cells formed vertical alignment, but no obvious cell alignment was found in B1B 2 group and C 1 C 2 group at each time point. Except that the mean of in A5 A6 group was significantly higher than that in D group (P0.05), there was no significant difference between the other groups (P0.05). Cytoskeleton staining showed that the cells in group A _ (5) A _ (6) formed a compact bundle cytoskeleton structure and tended to perpendicular to the direction of electric field vector. Cell death staining showed that the cell survival rate of A4A5A6 group was significantly lower than that of D group (P0.05), and there was no significant difference between the other groups and D group (P0.05). Calcium fluorescence staining showed that the intracellular calcium fluorescence intensity of group A _ (4) A _ (5) A _ (6) was slightly higher than that of group D, while that of other groups had no significant difference from that of group D. Conclusion the direct current electric field intensity of 5 V/cm and 6 V/cm can induce the directional arrangement of ADSCs, but the DC electric field intensity is lower than 5 V/cm and neither square wave nor biphasic pulse wave can induce the directional arrangement of cells, and the cell survival rate is negatively correlated with the electric field intensity.
【作者單位】： 成都航空職業(yè)技術(shù)學(xué)院工程實(shí)訓(xùn)中心;四川大學(xué)電氣信息學(xué)院醫(yī)學(xué)信息工程系;重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院骨科;四川大學(xué)華西醫(yī)院心臟大血管外科;
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81500213) 四川省教育廳科技項(xiàng)目(17ZA0019)~~
【分類號】：R329.2

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本文編號：2194729