【摘要】：MST4(mammalian Ste20-like kinases, MST)是絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶家族STE-20中生發(fā)中心激酶GCKⅢ (germinal central kinase)家族的成員,參與細胞的生長、凋亡、細胞極化等生理活動。MST4在N端含有保守的激酶結(jié)構(gòu)域,在C端的調(diào)控結(jié)構(gòu)域可調(diào)節(jié)激酶活性。為了獲得磷酸化狀態(tài)下MST4激酶結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu),本研究首先對表達在大腸桿菌中的人源MST4激酶結(jié)構(gòu)域擬磷酸化突變蛋白MST4(1-300)-D162A-T172/178E進行了純化、結(jié)晶,并利用X射線衍射進行了初步晶體學(xué)分析,得到的晶體結(jié)構(gòu)屬于P212121空間群,晶胞參數(shù)為a=69.63A,b=73.78A,c=127.10A,α=β=γ=90.0°,分辨率達到2.9A。另外,為了研究MST4與M025α的相互作用,本研究設(shè)計了MST4的5個片段,包括MST4全長(1-416)、MST4激酶結(jié)構(gòu)域(1-300)、MST4激酶結(jié)構(gòu)域及WEF基序(1-326)、MST4調(diào)控結(jié)構(gòu)域(325-416)、以及激酶結(jié)構(gòu)域失活突變體MST4(1-300)-D162A,將他們和M025a分別在大腸桿菌BL21(DE3)中表達,運用親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析進行純化,獲得了均一、穩(wěn)定、高純度的體外表達蛋白。利用這些體外純化的蛋白進行pull-down和解離平衡常數(shù)的測定,發(fā)現(xiàn)MST4(1-416)、(1-326)、(1-300)而非MST4(325-416)可以與M025α結(jié)合,結(jié)合強度也處于同一個數(shù)量級,說明激酶結(jié)構(gòu)域(1-300)為M025α結(jié)合所必需,且結(jié)合強度不受激酶結(jié)構(gòu)域以外區(qū)域影響；MST4(1-300)-D162A也可與M025α結(jié)合,說明這種結(jié)合不依賴于MST4的激酶活性。MST4與M025a共純化時,全長MST4以4+4的方式與M025a裝配,激酶結(jié)構(gòu)域以1+1的方式裝配。這些結(jié)果初步揭示了MST4與M025α相互作用的結(jié)合機制,為MST4-M025a二元復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)解析奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:MST4 (mammalian Ste20-like kinases, MST) is a member of germinal center kinase (GCK 鈪，

本文編號：2145905