發(fā)布時間：2018-07-26 14:05

【摘要】：破骨細(xì)胞是體內(nèi)唯一可以執(zhí)行骨吸收功能的細(xì)胞,來源于造血細(xì)胞系前體,單核-巨噬細(xì)胞。破骨細(xì)胞在骨代謝和重塑中起著關(guān)鍵的作用。破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收與成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成,通過一系列復(fù)雜的機制形成偶聯(lián),構(gòu)成了骨量的動態(tài)平衡。成纖維細(xì)胞具有向成骨分化的潛能,如今成纖維細(xì)胞的在骨化中的作用日益被人們重視。成纖維細(xì)胞(fibroblast,FB)是動物結(jié)締組織中最常見的細(xì)胞,由胚胎時期的間充質(zhì)細(xì)胞(mesenchymal cell)分化而來,主要功能是分泌細(xì)胞外基質(zhì)和膠原,維持結(jié)締組織結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)。在組織創(chuàng)傷修復(fù)和新血管生成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。另外,成纖維細(xì)胞參與了許多纖維化疾病的發(fā)病過程,如肺纖維化,腎纖維化,和硬皮病。成纖維細(xì)胞還具有一定的成骨能力,參與骨折愈合,并在強直性脊柱炎等疾病的異位骨化過程中發(fā)揮重要作用。成纖維細(xì)胞是如何向成骨樣細(xì)胞分化并引起軟組織骨化的機制尚不明確。但在成骨細(xì)胞的分化過程中破骨細(xì)胞起著至關(guān)重要的作用。破骨細(xì)胞條件培養(yǎng)基可通過Wnt/BMP信號通路和趨化因子鞘氨醇-1-磷酸誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。成纖維細(xì)胞與成骨細(xì)胞屬于同一個譜系。破骨細(xì)胞可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化,因此我們推斷成纖維細(xì)胞介導(dǎo)的異位骨化過程中,破骨細(xì)胞可能參與其中并發(fā)揮了重要作用。 研究目的:本研究的目的是了解人外周血單核細(xì)胞來源的破骨樣細(xì)胞與人韌帶成纖維細(xì)胞通過非接觸的方式進(jìn)行的體外相互作用。本課題著重(1)研究破骨細(xì)胞對人韌帶成纖維細(xì)胞礦化的誘導(dǎo)作用,并初步探索其作用機制;(2)觀察人韌帶成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基是否可以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體向破骨分化。 內(nèi)容和方法:用Ficoll-Paque密度梯度離心發(fā)分離外周血單個核細(xì)胞;并采用免疫磁珠法分選CD14~+單核細(xì)胞;CD14~+細(xì)胞經(jīng)M-CSF和RANKL兩種因子誘導(dǎo)向破骨樣細(xì)胞分化;通過形態(tài)觀察、耐酒石酸鹽酸性磷酸酶(TRAP)染色和掃描電鏡觀察骨吸收,鑒定破骨細(xì)胞特性。同時用膠原酶消化法從人的脊柱韌帶中原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞。破骨細(xì)胞條件培養(yǎng)基(Osteoclasts conditioned medium)處理韌帶成纖維細(xì)胞,BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒染色檢測成纖維堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá),茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié),并評估礦化水平。以正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞作對照,采用mRNA表達(dá)譜芯片和microRNA芯片檢測成纖維細(xì)胞mRNA和microRNA(miRNA)表達(dá)譜的變化,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,如差異表達(dá)基因的GO分析和pathway分析。利用另一例患者韌帶中原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞,重復(fù)條件培養(yǎng)基處理和芯片實驗。用成纖維細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)破骨細(xì)胞前體,即CD14~+單核細(xì)胞,觀察破骨細(xì)胞的分化。TRAP染色試劑盒檢測TRAP陽性表達(dá)率,RT-PCR檢測破骨分化標(biāo)志基因的表達(dá)情況。 結(jié)果:經(jīng)破骨樣細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞堿性磷酸酶表達(dá)陽性率較對照組顯著增高,茜素紅染色觀察到明顯的礦化結(jié)節(jié)。實驗組對照組相比,mRNA和miRNA的表達(dá)均有顯著差異。mRNA表達(dá)譜芯片檢測結(jié)果,522個基因上調(diào),415個基因下調(diào)兩倍以上;miRNA芯片結(jié)果,28個miRNA上調(diào),59個miRNA下調(diào)2倍以上。重復(fù)實驗中mRNA芯片檢測結(jié)果:3707個mRNA上調(diào),3251個mRNA下調(diào);microRNA芯片重復(fù)結(jié)果:23條miRNA上調(diào),36條miRNA下調(diào)。 成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理后的CD14~+單核細(xì)胞,具有40%的TRAP陽性率,同時經(jīng)RT-PCR檢測到TRAP和其他破骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)。 結(jié)論:破骨樣細(xì)胞可在體外誘導(dǎo)韌帶成纖維細(xì)胞發(fā)生礦化,而且這一過程中有miRNA參與表達(dá)調(diào)控。同時成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基可誘導(dǎo)CD14~+細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化,成纖維細(xì)胞與破骨細(xì)胞在代謝和分化過程中存在相互作用。
[Abstract]:Osteoclasts are the only cells in the body that can perform bone absorption, derived from the precursors of the hematopoietic cell line, monocyte macrophage. Osteoclast plays a key role in bone metabolism and remodeling. Osteoclast mediated bone absorption and osteoblast mediated bone formation, formed by a complex mechanism to form a bone mass. Dynamic balance. Fibroblasts have the potential to differentiate into osteogenic differentiation. Nowadays, the role of fibroblasts in ossification is becoming increasingly important. Fibroblast (FB) is the most common cell in the connective tissue of animal, which is differentiated from the embryonic mesenchyme (mesenchymal cell), and the main function is to secrete the extracellular matrix. And collagen, maintaining a connective tissue structure network. It plays a key role in tissue trauma repair and new angiogenesis. In addition, fibroblasts are involved in the pathogenesis of many fibrotic diseases, such as pulmonary fibrosis, renal fibrosis, and scleroderma. Fibroblasts also have a certain osteogenic ability to participate in fracture healing and in ankylosis. There is an important role in the process of heterotopic ossification of diseases such as spondylitis. The mechanism of fibroblast is how to differentiate into osteoblast like cells and cause soft tissue ossification. However, osteoclasts play a vital role in the differentiation of osteoblasts. The condition of osteoclast conditioned culture can be mediated through Wnt/BMP signaling pathway and chemotaxis. Factor sphingosine -1- phosphoric acid induces mesenchymal stem cells to differentiate into osteoblasts. Fibroblasts and osteoblasts belong to the same lineage. Osteoclasts can induce osteoblast differentiation. Therefore, we infer that osteoclasts may participate in and play an important role in the process of fibroblast mediated heterotopic ossification.
Objective: the purpose of this study is to understand the interaction of human peripheral blood mononuclear cells from osteoclast like cells and human ligamentous fibroblasts in vitro. This topic focuses on (1) the study of osteoclast induction for the mineralization of human ligamentous fibroblasts and preliminary exploration of its mechanism of action; (2) observe human toughening Can fibroblast conditioned medium induce osteoclast precursors to osteoclast differentiation?
Contents and methods: isolated peripheral blood mononuclear cells were separated by Ficoll-Paque density gradient centrifugation, and CD14~+ mononuclear cells were separated by immunomagnetic beads; CD14~+ cells were induced to differentiate into osteoclast like cells by two factors of M-CSF and RANKL; the morphological observation, tartarate acid phosphatase (TRAP) staining and scanning electron microscopy were used to observe bone absorption. The characteristics of the osteoclast were fixed. At the same time, the fibroblasts were cultured in the human spinal ligament with collagenase digestion. The osteoclast conditioned medium (Osteoclasts conditioned medium) was used to treat the ligament fibroblasts and the BCIP/NBT alkaline phosphatase chromogenic kit was used to detect the expression of fibrinolytic alkaline phosphatase (ALP), and the alizarin red staining view The mineralized nodules were observed and the mineralization level was evaluated. The expression profiles of mRNA and microRNA (miRNA) in fibroblasts were detected by mRNA expression chip and microRNA chip, and the bioinformatics analysis, such as GO analysis and pathway analysis of differentially expressed genes, was used to make use of another patient's toughening. The fibroblasts cultured in the Central Plains, the repeated conditioned medium and the chip experiment. The osteoclast precursor was cultured in the conditioned medium of fibroblasts, the CD14~+ mononuclear cells were cultured. The positive rate of TRAP was detected by the differentiation.TRAP staining kit of osteoclasts, and the expression of the osteoclast differentiation marker gene was detected by RT-PCR.
Results: the positive rate of alkaline phosphatase expression in fibroblasts cultured with osteoclast cell conditioned medium was significantly higher than that of the control group. Alizarin red staining observed obvious mineralized nodules. Compared with the control group, the expression of mRNA and miRNA were significantly different from the.MRNA expression spectrum chip detection results, 522 genes were up and 415 genes were down regulated. More than two times, miRNA chip results, 28 miRNA up, 59 miRNA down 2 times. Repeat experiment mRNA chip detection results: 3707 mRNA up, 3251 mRNA downregulation, microRNA chip repeat results: 23 miRNA up, 36 miRNA downregulation.
CD14~+ mononuclear cells treated with fibroblast conditioned medium had a positive rate of 40% TRAP, and the expression of TRAP and other osteoclast differentiation markers were detected by RT-PCR.
Conclusion: osteoclast like cells can induce the mineralization of ligamentous fibroblasts in vitro, and miRNA participates in the regulation of expression in this process. At the same time, the conditioned medium of fibroblasts can induce the differentiation of CD14~+ cells to osteoclasts, and the interaction between fibroblasts and osteoclasts in the process of metabolism and differentiation.
【學(xué)位授予單位】：濟南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329.2

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本文編號：2146257