本文選題：骨髓間充質干細胞 + 缺血肌袋�。� 參考：《昆明醫(yī)學院》2011年碩士論文

【摘要】：目的：1、建立培養(yǎng)增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)轉基因C57BL/6雄性小鼠骨髓間充質干細胞(bone Mesenchymal stem cells, BMSCs)的分離培養(yǎng)方法。 2、研究同種異體骨髓間充質干細胞(bone Mesenchymal stem cells, BMSCs)在同種小鼠缺血損傷肌袋內定植存活及向缺血損傷肌袋歸巢的能力。 方法：1、EGFP-BMSCs勺分離培養(yǎng)和純度鑒定：貼壁法培養(yǎng)擴增增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)轉基因C57BL/6雄性小鼠的EGFP-BMSCs,體外擴增傳代至第5代,行流式細胞學鑒定EGFP-BMSCs純度。 2、動物分組及模型建立：取C57BL/6小鼠90只,隨機分為三組,每組30只：A組(股四頭肌缺血肌袋模型局部注射組)：制作小鼠右側股四頭肌缺血肌袋模型(游離股四頭肌,結扎其遠近端,下同),注入同種異體濃度為2x106個/ml的EGFP-BMSCs懸液0.01ml(下同),左側股四頭肌肌袋注入0.01ml生理鹽水做為對照；B組(正常股四頭肌肌袋模型局部注射組)：暴露小鼠雙側股四頭肌,取0.01mlEGFP-BMSCs注入小鼠右側股四頭肌肌袋內,取0.01ml生理鹽水注入左側股四頭肌肌袋做為對照；C組(股四頭肌缺血肌袋模型尾靜脈注射組)：暴露小鼠雙側股四頭肌,制作小鼠右側股四頭肌缺血肌袋,經(jīng)尾靜脈注射0.01mlEGFP-BMSCs。 3、術后一天,四天,一周,兩周,四周隨機處死A、B、C三組各6只受體小鼠,分別獲取各組小鼠雙側肌袋組織,提取不同時間點不同的肌袋組織蛋白行Western-blot檢測,計算其灰度比值,并做統(tǒng)計分析。原代培養(yǎng),經(jīng)過換液和傳代,可以獲得大量較純的EGFP-BMSCs。 2、注入同種異體EGFP-BMSCs后,宿主C57BL/6小鼠均無明顯異常反應。 3、術后一天、四天、一周、兩周、四周時處死動物并提取A、B、C三組雙側股四頭肌肌袋蛋白,Western-blot檢測結果顯示A組、B組和C組的右側肌袋內不同時間段均可以檢測到增強型綠色熒光蛋白(EGFP),以術后一天最多,但隨時間延長而逐漸減少。 4、三組對照側左側不同時間段肌袋標本內均未檢測到EGFP。 5、統(tǒng)計分析：用Quantity one軟件分析EGFP在不同時間局部缺血注射組、局部未缺血注射組和全身注射組的Western blot條帶,所得各數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS16.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析。 結論：1、全骨髓貼壁法可以從骨髓中成功分離培養(yǎng)出EGFP轉基因C57BL/6小鼠的EGFP-BMSCs. 2、通過結扎股四頭肌可成功建造小鼠缺血肌袋模型。 3、宿主對同種異體EGFP-BMSCs無明顯免疫排斥反應。 4、局部注射同種異體EGFP-BMSCs可在宿主局部肌袋存活4周以上；局部注射EGFP-BMSCs有局部富集現(xiàn)象,可作為干細胞治療的一條可行途徑。 5、尾靜脈注射(全身注射)EGFP-BMSCs能通過非血管途徑歸巢至宿主缺血損傷肌袋,并能定植存活4周以上,但隨時間延長EGFP-BMSCs量逐漸減少。 6、歸巢至小鼠缺血肌袋的EGFP-BMSCs可能參與損傷修復及血管的形成。
[Abstract]:Objective to establish a method for isolation and culture of bone mesenchymal stem cells (BMSCs) from C57BL / 6 male mice transgenic with enhanced green fluorescent protein (enhanced green fluorescent protein, EGFP). (2) to study allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). The ability of bone mesenchymal stem cells (BMSCs) to survive and homing to ischemic injury muscle pouch in allogeneic mice. Methods the EGFP-BMSCs were isolated, cultured and purified. EGFP-BMSCs of C57BL / 6 transgenic C57BL / 6 male mice were amplified by adherent method and then subcultured to the fifth generation in vitro. The purity of EGFP-BMSCs was determined by flow cytometry, and the animal groups and models were established. Ninety C57BL / 6 mice were randomly divided into three groups. 30 rats in each group (local injection group of quadriceps femoris ischemia muscle pouch model): the right quadriceps femoris ischemia muscle pouch model (free quadriceps femoris, ligation of its far and near end), In the same way, EGFP-BMSCs suspension (0.01ml) was injected with allogenic concentration of 2x106 / ml, and the left quadriceps muscle bag was injected with 0.01ml normal saline as control group B (normal quadriceps muscle pouch model local injection group): bilateral quadriceps muscle was exposed to mice. 0.01 ml EGFP-BMSCs were injected into the right quadriceps muscle pouch of mice, and 0.01ml saline was injected into the left quadriceps muscle bag as control group C (caudal vein injection group): bilateral quadriceps muscle was exposed. The right quadriceps femoris muscle ischemic muscle bag was made in mice, and 0.01ml EGFP-BMSCs.3 was injected into caudal vein. One day, four days, one week, two weeks, and four weeks after operation, the mice in each group were killed at random. The tissue proteins of muscle bags were extracted at different time points and detected by Western-blot. The grayscale ratio was calculated and analyzed statistically. After primary culture, a large number of pure EGFP-BMSCs 路2 could be obtained by medium exchange and passage. After injection of EGFP-BMSCs, host C57BL / 6 mice had no obvious abnormal response. 3, one day, four days, one week, two weeks after operation, The results of Western-blot analysis showed that enhanced green fluorescent protein (EGFP) could be detected in the right muscle pouch of group A and group C at different time points, the most of which was on the first day after operation, and the results of Western-blot analysis showed that the enhanced green fluorescent protein (EGFP) could be detected at different time points in the right muscle pocket of group A and C. However, with the prolongation of time, EGFP was decreased gradually. 4. EGFP was not detected in the muscle bag specimens of the left side of the three groups at different time points. Statistical analysis: the quantitative one software was used to analyze EGFP in the different time ischemic injection group. All the data were analyzed by SPSS 16.0 software. Conclusion the EGFP transgenic C57BL / 6 mouse EGFP-BMSCs.2 can be successfully isolated from bone marrow by whole bone marrow adherent method. By ligating quadriceps femoris, the ischemic muscle bag model of mice can be successfully constructed. 4. Local injection of EGFP-BMSCs could survive for more than 4 weeks. Local injection of EGFP-BMSCs can be a feasible way to treat stem cells. 5. Caudal vein injection (whole body injection) EGFP-BMSCs can homing to host ischemic injury muscle bag through non-vascular pathway, and can be colonized for more than 4 weeks. However, the number of EGFP-BMSCs gradually decreased with the prolongation of time. The EGFP-BMSCs homing to the ischemic muscle pouch of mice may participate in the repair of injury and the formation of blood vessels.
【學位授予單位】：昆明醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

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