本文選題：人Toll樣受體- + 核因子-κB　； 參考：《國際藥學(xué)研究雜志》2017年05期

【摘要】：目的構(gòu)建人Toll樣受體-5(hTLR5)和NF-κB信號通路響應(yīng)的熒光素酶(luciferase)-綠色熒光蛋白(GFP)報告分子的慢病毒質(zhì)粒,獲得穩(wěn)定表達(dá)hTLR5及NF-κB響應(yīng)報告分子的HEK-293細(xì)胞系。方法通過PCR及全基因合成方法獲得hTLR5和5×NF-κB結(jié)合位點序列,分別構(gòu)建pWSLV-hTLR5-puro和pWSLV-5×NF-κB-nanluc-GFP慢病毒質(zhì)粒;將2個慢病毒質(zhì)粒分別與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞進行慢病毒包裝,將獲得的慢病毒上清經(jīng)濃縮后共感染HEK-293細(xì)胞,經(jīng)嘌呤霉素篩選和流式細(xì)胞分選后得到表達(dá)hTLR5及NF-κB響應(yīng)報告分子的HEK-293細(xì)胞。經(jīng)傳代后,采用Western印跡法和免疫熒光法鑒定hTLR5表達(dá)情況,熒光顯微鏡下觀察并采用熒光素酶定量法檢測不同濃度細(xì)菌鞭毛蛋白(flagellin)對NF-κB信號通路的激活情況。結(jié)果質(zhì)粒酶切鑒定及DNA測序結(jié)果表明插入目的片段與預(yù)期相符,重組慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建正確;HEK293-N-T細(xì)胞高表達(dá)hTRL5,且hTLR5能正確定位到細(xì)胞膜表面;鞭毛蛋白能顯著激活HEK293-N-T細(xì)胞的NF-κB信號通路,且具有劑量依賴關(guān)系。結(jié)論正確構(gòu)建了hTLR5和NF-κB信號通路響應(yīng)的熒光素酶-GFP報告分子的慢病毒質(zhì)粒,并成功建立了穩(wěn)定表達(dá)hTLR5及NF-κB響應(yīng)報告分子的HEK-293細(xì)胞系。
[Abstract]:Objective to construct the lentiviral plasmid of human Toll-like receptor 5 (hTLR5) and NF- 魏 B signal pathway responsive luciferase (luciferase) green fluorescent protein (GFP) reporter molecules and to obtain HEK-293 cell lines stably expressing hTLR5 and NF- 魏 B response reporter molecules. Methods pWSLV-hTLR5-puro and pWSLV-5 脳 NF- 魏 B-nanluc-GFP lentivirus plasmids were constructed by polymerase chain reaction (PCR) and complete gene synthesis, and the two lentivirus plasmids were cotransfected into HEK-293T cells for lentiviral packaging. The purified lentivirus supernatant was coinfected with HEK-293 cells. After purine mycin screening and flow cytometry sorting, HEK-293 cells expressing hTLR5 and NF- 魏 B responsive reporter molecules were obtained. After passage, the expression of hTLR5 was identified by Western blotting and immunofluorescence. The activation of NF- 魏 B signaling pathway by different concentrations of bacterial flagellin (flagellin) was detected by fluorescence microscope and luciferase quantitative method. Results the results of restriction endonuclease digestion and DNA sequencing showed that the inserted target fragment was in accordance with the expectation. The recombinant lentivirus plasmid was constructed correctly to express hTRL5 on HEK293-N-T cells, and hTLR5 could be correctly located on the surface of cell membrane. Flagellin can activate NF- 魏 B signaling pathway in HEK293-N-T cells in a dose-dependent manner. Conclusion Lentivirus plasmids of luciferase -GFP reporter molecules responding to hTLR5 and NF- 魏 B signaling pathway were constructed correctly, and HEK-293 cells stably expressing hTLR5 and NF- 魏 B response reporter molecules were successfully established.
【作者單位】： 北京藥物化學(xué)研究所;
【基金】：國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項資助項目(2009ZX09103-384)
【分類號】：R392

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本文編號：2107453