本文選題：單純皰疹病毒Ⅱ型 + 潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄體�。� 參考：《華南理工大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：單純皰疹病毒Ⅱ型(Herpes Simplex VirusⅡ,HSV-2)是一種常見的人類病毒性疾病病原體,主要引起生殖器皰疹(genital herpes,GH)。HSV-2侵染人體后不但引起原發(fā)性感染,并可在骶尾神經(jīng)節(jié)內(nèi)以休眠的狀態(tài)建立潛伏感染。這種潛伏往往是終生的,并伴隨體內(nèi)外各種非特異性刺激而活化,導(dǎo)致相關(guān)臨床癥狀復(fù)發(fā),造成復(fù)發(fā)感染。正因為這種潛伏復(fù)發(fā)機(jī)制導(dǎo)致HSV能夠逃避免疫系統(tǒng)的消滅而難以根除。目前尚不明確單純皰疹病毒的潛伏復(fù)發(fā)機(jī)制,這是臨床上徹底治愈HSV-2感染的瓶頸所在。 潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄體(Latency associated transcript,LAT)是HSV潛伏感染期間唯一大量存在的轉(zhuǎn)錄物,多年的研究表明LAT在HSV潛伏的建立、保持和活化過程中起著不可替代的作用。 學(xué)者們對LAT功能的研究,雖然已提出多種假說,但爭議很大。HSV-2 LAT含有三個開放讀碼框(Open Reading Frame,ORF),有研究指出LAT的開放讀碼框可以編碼抗凋亡作用的蛋白來抑制其宿主細(xì)胞的凋亡,從而保持HSV-2的潛伏感染狀態(tài)。 據(jù)此,本研究構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pEGFP-ORF3。將重組質(zhì)粒pEGFP-ORF3轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后,研究其在Vero細(xì)胞中表達(dá)及抗順鉑誘導(dǎo)的凋亡作用。 首先,以HSV-2 333株基因組為模板,PCR擴(kuò)增獲得LAT ORF3序列,PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pEGFP-C2經(jīng)EcoRI、KpnI雙酶切后,T4連接酶連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10菌株,經(jīng)抗性篩選后獲得重組質(zhì)粒pEGFP-ORF3,雙酶切及測序鑒定重組質(zhì)粒pEGFP-ORF3構(gòu)建成功。Xfect轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)pEGFP-ORF3轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞,48h后將細(xì)胞放在倒置熒光顯微鏡下,觀察綠色熒光蛋白標(biāo)記的ORF3片段的表達(dá),RT-PCR確定其mRNA在Vero細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成功。 重組質(zhì)粒pEGFP-ORF3轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后,熒光顯微鏡觀察到ORF3在細(xì)胞中高效表達(dá);融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的分布量要顯著少于細(xì)胞核中。本實驗使用常見誘導(dǎo)劑順鉑對各組細(xì)胞進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)后,通過倒置熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)特征及Giemsa染色觀察細(xì)胞核的變化,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-ORF3的細(xì)胞與正常細(xì)胞無顯著差異;MTT法分析細(xì)胞增殖情況與正常細(xì)胞無差異而顯著高于空質(zhì)粒組;流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率與正常細(xì)胞無顯著差異,而顯著低于空質(zhì)粒組。 這些研究結(jié)果表明,HSV-2 LAT ORF3具有抵抗順鉑誘導(dǎo)的Vero細(xì)胞凋亡的功能。本研究構(gòu)建的重組真核表達(dá)載體pEGFP-ORF3能在Vero細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá),并證實了其抗細(xì)胞凋亡的功能,為進(jìn)一步研究HSV-2 LAT介導(dǎo)的潛伏復(fù)發(fā)機(jī)制奠定了一定的實驗基礎(chǔ)。
[Abstract]:Herpes Simplex virus 鈪，

本文編號：2084526