本文選題：MAVS + TRAF3�。� 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2012年博士論文

【摘要】：先天性免疫系統(tǒng)是機(jī)體識別和清除入侵病原體的第一道防線，具有作用廣泛、啟動迅速的特點(diǎn)，在保護(hù)機(jī)體、抵抗感染的過程中具有極其重要的作用。先天性免疫應(yīng)答的激活主要通過宿主的模式識別受體(PRRs)識別病原微生物的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，進(jìn)而招募相應(yīng)的接頭蛋白，激活信號級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)I型干擾素、促炎細(xì)胞因子、趨化因子的分泌和表達(dá)，從而殺傷和清除病原微生物。針對不同的病原相關(guān)分子模式，機(jī)體有不同的模式識別受體應(yīng)答。目前發(fā)現(xiàn)的模式識別受體包括三種：TLRs、RLRs和NLRs。它們可以通過激活NF-B和IRF等轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)I型干擾素等基因的轉(zhuǎn)錄，也可以通過起始胞漿內(nèi)炎癥小體復(fù)合物(inflammsome)的組裝促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的成熟與釋放。炎癥小體由受體蛋白，接頭蛋白ASC和效應(yīng)分子pro-caspase-1構(gòu)成。宿主炎癥小體的功能狀態(tài)與病原微生物的致病性密切相關(guān)，一方面炎癥小體的適度激活具有殺滅病原體以及抑制感染的作用；另一方面，過度的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致多種組織和器官傷害，甚至危及生命。因此，炎癥小體需要精準(zhǔn)的調(diào)控，鑒定和篩選新的炎癥小體調(diào)控分子對于抵抗病原微生物感染具有十分重要的意義。 凋亡相關(guān)點(diǎn)狀蛋白ASC作為炎癥小體信號通路中關(guān)鍵的接頭蛋白，在信號傳遞過程中必不可少。它通過PYRIN和CARD結(jié)構(gòu)域連接受體蛋白和pro-caspase-1，使pro-caspase-1切割為有活性的caspase-1，最終促進(jìn)IL-1和IL-18等成熟和分泌。鑒于ASC在炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞因子成熟過程中的重要作用，我們將其作為靶點(diǎn)篩選參與炎癥小體激活的新調(diào)控分子，通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)線粒體抗病毒信號蛋白MAVS有可能和ASC相互作用，進(jìn)一步研究表明： 1. MAVS與ASC發(fā)生相互作用：通過免疫共沉淀、GST-pulldown、線粒體分離、免疫熒光、免疫印跡等方法，發(fā)現(xiàn)MAVS與ASC在體內(nèi)外形成復(fù)合物；通過構(gòu)建截短突變體等方法，發(fā)現(xiàn)MAVS通過CARD和TM結(jié)構(gòu)域與ASC的CARD結(jié)構(gòu)域相互作用。 2. MAVS通過上調(diào)ASC的蛋白穩(wěn)定性促進(jìn)其介導(dǎo)的IL-1產(chǎn)生：ELISA結(jié)果表明，MAVS能促進(jìn)ASC介導(dǎo)的IL-1產(chǎn)生，該現(xiàn)象依賴于MAVS的CARD結(jié)構(gòu)域、TM結(jié)構(gòu)域及其二聚化；免疫印跡結(jié)果表明，過表達(dá)的MAVS能上調(diào)ASC的蛋白水平，敲低細(xì)胞內(nèi)源MAVS的表達(dá)導(dǎo)致ASC的蛋白水平降低；RT-PCR結(jié)果表明，MAVS不影響ASC的mRNA水平。 3. MAVS通過E3泛素連接酶TRAF3調(diào)控ASC：通過篩選6種與MAVS密切相關(guān)的E3泛素連接酶，發(fā)現(xiàn)TRAF3可以增強(qiáng)ASC的蛋白穩(wěn)定性及其介導(dǎo)的IL-1水平；進(jìn)一步研究表明，TRAF3能與ASC相互作用并使其泛素化，而喪失了E3連接酶功能的TRAF3(C53AC56A)和TRAF3(C68AH70A)突變體不能泛素化ASC；在TRAF3knockdown細(xì)胞中，MAVS不能明顯上調(diào)ASC的蛋白穩(wěn)定性。 4. TRAF3催化ASC K174位發(fā)生K63-連接的泛素化：通過構(gòu)建一系列Ub的KR突變體，發(fā)現(xiàn)TRAF3催化ASC發(fā)生K63-連接的泛素化；通過構(gòu)建一系列ASC的KR突變體，發(fā)現(xiàn)ASC第174位賴氨酸是可能的泛素化位點(diǎn)；與野生型ASC相比，ASC(K174R)突變體的蛋白穩(wěn)定性及其介導(dǎo)的IL-1水平均不受MAVS與TRAF3的影響。 5.病毒感染后ASC的核質(zhì)穿梭依賴于TRAF3對其泛素化修飾：VSV感染后，ASC出現(xiàn)明顯的泛素化修飾與核質(zhì)穿梭；與野生型細(xì)胞相比，在MAVS與TRAF3knockdown細(xì)胞中，，病毒感染引起的ASC的泛素化修飾水平降低，核質(zhì)穿梭現(xiàn)象減弱。核質(zhì)分離和免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，病毒感染后，TRAF3促進(jìn)野生型ASC由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，而對ASC(K174R)突變體的細(xì)胞定位無明顯影響。 6.病毒感染后MAVS與TRAF3促進(jìn)炎癥小體的激活：與野生型MEF細(xì)胞相比，在MAVS-/-與TRAF3-/-細(xì)胞中，SeV感染誘導(dǎo)的pro-caspase-1的切割減弱、IL-1水平下降；用VSV分別感染野生型與MAVS-/-小鼠的BMDC細(xì)胞后，MAVS-/-細(xì)胞中pro-caspase-1的切割程度與caspase-1的酶活性均低于野生型細(xì)胞。 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MAVS通過E3泛素連接酶TRAF3，上調(diào)ASC的蛋白穩(wěn)定性，促進(jìn)其介導(dǎo)的IL-1產(chǎn)生。TRAF3催化ASC發(fā)生K63-連接的泛素化修飾，修飾的可能位點(diǎn)為ASC第174位賴氨酸。進(jìn)一步研究表明，ASC的泛素化能介導(dǎo)病毒感染誘導(dǎo)的核質(zhì)穿梭，在此基礎(chǔ)上促進(jìn)炎癥小體的激活。本研究不但鑒定了新的炎癥小體調(diào)控因子，闡明了MAVS與TRAF3調(diào)控炎癥小體的分子機(jī)制，同時(shí)也為揭示不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間的交聯(lián)機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。
[Abstract]:The present invention relates to a kind of pattern recognition receptor , which is composed of receptor protein , linker protein ASC and effector molecule pro - caspase - 1 . The present invention has the functions of activating NF - B and IRF and promoting the maturation and release of pro - inflammatory cytokines .
On the other hand , excessive inflammatory reaction can lead to injury of various tissues and organs , even life - threatening . Therefore , it is very important to regulate , identify and screen new inflammatory small - body regulatory molecules to resist pathogenic microorganism infection .

In view of the important role of ASC in the process of cytokine maturation mediated by inflammatory small body , we use it as a target to screen the active caspase - 1 and eventually promote the maturation and secretion of IL - 1 and IL - 18 . In view of the important role of ASC in the pathogenesis of inflammatory small body mediated cytokine maturation , we find that the mitochondrial antiviral signaling protein MAVS can interact with ASC by yeast two - hybrid experiment .

1 . MAVS interacting with ASC : MAVS and ASC were found to form complexes in vivo by means of immune codeposition , GST - transferase , mitochondrial separation , immunofluorescence , Western blotting , etc .
By constructing truncated mutants and the like , MAVS was found to interact with the CARD domain of ASC through CARD and TM domains .

2 . MAVS promotes its mediated IL - 1 production by up - regulation of the protein stability of ASC : ELISA results show that MAVS can promote the production of ASC - mediated IL - 1 , which depends on the CARD domain , TM domain and dimerization of MAVS ;
Western blot analysis showed that the overexpression of MAVS could up - regulate the protein level of ASC , and the expression of MAVS in low cell line could decrease the protein level of ASC .
RT - PCR showed that MAVS did not affect the mRNA level of ASC .

3 . MAVS regulated ASC by E3 ubiquitin ligase TRAF3 : by screening six E3 ubiquitin ligase closely related to MAVS , TRAF3 could enhance the protein stability of ASC and its mediated IL - 1 level ;
Further studies have shown that TRAF3 can interact with ASC and ubiquitination , while TRAF3 ( C53AC56 ) and TRAF3 ( C68AH70A ) mutants with loss of E3 ligase function do not ubiquitinated ASC ;
MAVS could not up - regulate the protein stability of ASC in mammalian cells .

4.TRAF3 catalyzes the ubiquitination of K63 - connections in ASC K174 sites : K63 - linked ubiquitination of the K63 - connection is found catalyzed by TRAF3 by constructing a series of KR mutants of Ub ;
By constructing a series of KR mutants of ASC , it was found that the 174 lysine in ASC was a possible ubiquitination site ;
Compared with wild - type ASC , the protein stability of ASC ( K174R ) mutant and its mediated IL - 1 level were not influenced by MAVS and TRAF3 .

5 . The nuclear shuttle of ASC after virus infection depends on TRAF3 ' s ubiquitination modification : after the infection , the ASC has obvious ubiquitination modification and nuclear shuttle ;
Compared with wild - type cells , the ubiquitination modification level of ASC induced by viral infection decreased and the nuclear shuttle phenomenon was weakened . After virus infection , TRAF3 promoted the transfer of wild - type ASC from nucleus to cytoplasm , and had no obvious effect on cell localization of ASC ( K174R ) mutant .

6 . MAVS and TRAF3 after viral infection promote the activation of inflammatory cells : in MAVS - / - and TRAF3 - / - cells , the cleavage of pro - caspase - 1 induced by SeV infection decreased and the level of IL - 1 was decreased compared with wild type MEFs .
The cleavage degree of pro - caspase - 1 and the activity of caspase - 1 in MAVS - / - cells were lower than that of wild - type cells after infected with BMDC cells of wild - type and MAVS - / - mice , respectively .

In conclusion , the study found that MAVS increased the protein stability of ASC by E3 ubiquitin ligase TRAF3 , and promoted its mediated IL - 1 production . TRAF3 catalyzed ASC to produce K63 - linked ubiquitination modification , and the possible site of modification was ASC 174 lysine .
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

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本文編號：2074654