本文選題：肉毒毒素 + 單克隆抗體�。� 參考：《上海交通大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：肉毒毒素(botulinumtoxins,BoNTs)是肉毒梭狀芽孢桿菌在厭氧條件下產(chǎn)生的一組外毒素蛋白,它可導(dǎo)致神經(jīng)中毒癥狀,是目前已知的自然界中最毒的物質(zhì)。BoNTs有七種血清型(A-G),各型均為雙鏈蛋白分子(分子量150KD),由重鏈(HC-100KD)和輕鏈(LC-50KD)通過二硫鍵連接。輕鏈?zhǔn)谴呋δ芙Y(jié)構(gòu)域具有內(nèi)肽酶的活性。重鏈由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成;與膜轉(zhuǎn)位相關(guān)的N端結(jié)構(gòu)域(HN)和與神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的C端結(jié)合域(Hc)。研究表明,BoNT/Hc包含保護(hù)性抗原基本決定簇作為免疫原能引發(fā)顯著的保護(hù)性應(yīng)答。肉毒毒素通過作用于神經(jīng)細(xì)胞,抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,引起松弛性神經(jīng)麻痹,肉毒中毒是一種致死率很高的疾病,自然狀況下,A、B、E、F型肉毒毒素是引起人類中毒的主要類型。使用中和保護(hù)性抗血清治療是目前治療肉毒毒素中毒的最有效的手段。目前尚無能夠有效保護(hù)BoNTs的中和保護(hù)性單克隆抗體用于臨床治療。因此研究抗BoNTs的中和保護(hù)性單克隆抗體及其識(shí)別表位和作用機(jī)制,對(duì)研制預(yù)防性疫苗、制備治療性抗體具有重要意義。本論文旨在利用雜交瘤技術(shù)篩選獲得具有中和活性的單克隆抗體。鑒定抗體的體內(nèi)、外中和保護(hù)活性,通過噬菌體展示技術(shù),淘選抗體識(shí)別的中和表位,進(jìn)而分析BoNT/Hc結(jié)構(gòu)上的功能結(jié)構(gòu)域與抗體結(jié)合表位的關(guān)系。初步闡明抗體中和保護(hù)作用的機(jī)制,為治療性肉毒毒素抗體的研發(fā)提理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究主要包括以下幾個(gè)部分:一、BoNT/AHc、BoNT/BHc、BoNT/EHc和BoNT/FHc的表達(dá)和純化我們分別全基因合成了BoNT/AHc、BoNT/BHc、BoNT/EHc和BoNT/FHc DNA序列,并構(gòu)建了大腸桿菌原核表達(dá)載體。成功地可溶性表達(dá)了BoNT/AHc、BoNT/BHc、BoNT/EHc和BoNT/FHc蛋白,并WB驗(yàn)證之。二、抗BoNTs單克隆抗體的篩選、鑒定和制備我們以表達(dá)純化的bont/bhc蛋白作為免疫原,采用常規(guī)的雜交瘤技術(shù)制備了分泌結(jié)合bont/bhc抗體的16株雜交瘤細(xì)胞株,經(jīng)初步篩選和鑒定獲得3株結(jié)合在bont/bhc不同功能區(qū)域且具中和保護(hù)活性的抗體(2f4、5g10、8e10、),其中8e10抗體具有型交叉結(jié)合活性。并對(duì)它們亞型及親和力進(jìn)行了測(cè)定。三、3株抗體體內(nèi)中和保護(hù)活性檢測(cè)采用經(jīng)典的小鼠體內(nèi)攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)了3株抗體的bont/b中和保護(hù)活性,抗體中和保護(hù)活性的檢測(cè)結(jié)果表明,3株抗體都能完全中和保護(hù)10倍ld50sbont/b的攻擊,40倍ld50bont/b的攻毒擊時(shí),2f4和5g10抗體能完全保護(hù)小鼠,無一死亡;8e10抗體也能延長小鼠生存時(shí)間達(dá)72h左右。而且8e10對(duì)bont/a、bont/e、bont/f還有較強(qiáng)的交叉中和保護(hù)活性。四、抗體表位的淘選、鑒定及其保護(hù)機(jī)制的研究為了分析2f4、5g10和8e10抗體所識(shí)別的中和表位,首先采用噬菌體隨機(jī)12肽庫對(duì)這三株抗體所識(shí)別的表位分別進(jìn)行淘選,獲得它們識(shí)別的表位序列。然后,通過合成表位肽的競(jìng)爭性elisa實(shí)驗(yàn)鑒定抗體識(shí)別表位。序列比對(duì)結(jié)果表明:3株抗體所識(shí)別的表位序列均位于bont/bhc的受體結(jié)合區(qū)域:2f4識(shí)別表位1114kxsp1117和5g10識(shí)別的表位1201sdxfy1205均與bont/bhc的蛋白受體結(jié)合域部分重疊,但兩表位完全不重疊;8e10所識(shí)別的表位1259sxwy1262位于bonts保守的gt1b受體結(jié)合域(h…sxwy…g)內(nèi)。wb和elisa實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)8e10交叉結(jié)合四種毒素hc蛋白。五、不同識(shí)別表位的抗體間的協(xié)同作用及其機(jī)制研究為了研究這三株識(shí)別的表位不重疊的抗體是否具有保護(hù)協(xié)同作用,我們分別檢測(cè)單株抗體和不同株抗體間組合的體內(nèi)中和保護(hù)效果,對(duì)比發(fā)現(xiàn)結(jié)合在gt1b受體結(jié)合位點(diǎn)上的8e10抗體,與分別結(jié)合sytii的結(jié)合位點(diǎn)上不重疊抗原表位的抗體5g10或2f4組合有協(xié)同作用,然而,盡管5g10和2f4分別結(jié)合sytii結(jié)合的區(qū)域不重疊的位點(diǎn),但兩者組合沒有協(xié)同作用。8e10的結(jié)合表位在bont/a,b,e和f中是高度保守的。它可以交叉保護(hù)不同血清型的bonts攻擊。因此,這株抗體有望成為一個(gè)與結(jié)合在其他毒素功能結(jié)構(gòu)域的抗體一起有協(xié)同保護(hù)作用的通用的伙伴抗體�？傊�,本研究經(jīng)篩選、鑒定獲得了3株具有中和保護(hù)活性的單克隆抗體(8E10、5G10、2F4),采用噬菌體隨機(jī)12肽庫對(duì)這三株抗體所識(shí)別的抗原表位進(jìn)行淘選,獲得其識(shí)別的表位序列。研究了具有中和保護(hù)活性的抗體識(shí)別的表位及其機(jī)制,并探討了8E10抗體的交叉保護(hù)機(jī)制,揭示了識(shí)別不同表位的抗體的協(xié)同效應(yīng)機(jī)制。為肉毒中毒的預(yù)防和治療性抗體的研制及應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)和設(shè)計(jì)依據(jù)。
[Abstract]:BoNT / Hc , BoNT / BHc , BoNT / EHc , BoNT / EHc and BoNT / FHC have been successfully used in the study of anti - BoNT / Hc , BoNT / BHc , BoNT / EHc and BoNT / FHC . in ord to study that protective effect of monoclonal antibodies ( 8E10 , 5G10 , 2F4 ) which bind to the binding sites of the other toxin , it was found that the monoclonal antibodies ( 8E10 , 5G10 , 2F4 ) which bind to the binding sites of the other toxin were highly conserved .
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2074886