本文選題：維生素C + 小鼠誘導多能干細胞��； 參考：《重慶醫(yī)科大學》2011年碩士論文

【摘要】：目的:探討維生素C作為誘導劑對小鼠誘導多能干細胞(miPSc)體外分化為心肌細胞的影響。 方法:1.復蘇miPSc,從細胞形態(tài)、干細胞全能性基因Oct-4的表達及堿性磷酸酶染色鑒定其全能性。比較不同差速貼壁時間去除飼養(yǎng)層細胞后對懸滴法形成規(guī)則擬胚體(EBs)數(shù)量的影響;比較不同細胞接種濃度對直接懸浮法形成規(guī)則EBs數(shù)量的影響。觀察由miPSc形成的EBs的體外發(fā)育過程的形態(tài)學改變。 2.比較含不同摩爾濃度的維生素C的分化培養(yǎng)液(10~(-3)mol/l,10~(-4) mol/l,10~(-5) mol/l,10~(-6) mol/l)對懸浮法得到的EBs分化為心肌細胞的效率的差別,并對分化出的搏動區(qū)域進行心肌細胞特異性蛋白cTnT及α-actin的鑒定。用Percoll密度梯度離心法對EBs分化而來的細胞進行心肌細胞的分離和提純,并行心肌特異性蛋白cTnT和α-actin的鑒定。 結果:1.光鏡下iPSc呈集落樣生長,似鳥巢。熒光顯微鏡下,iPSc集落團發(fā)出明暗相間的綠色熒光(Oct-4啟動),堿性磷酸酶染色結果顯示我們培養(yǎng)的iPSc集落團著深藍色。 2.用懸滴-懸浮兩步法制作EBs,在差速貼壁15min,30min,60min以及90min去除飼養(yǎng)層后,以差速貼壁60min的效果最好,規(guī)則EBs的比率達67.82±5.10~%,與其它各組比較差異有顯著性(P0.05)。 3.用懸浮一步法制作EBs,調(diào)整細胞密度為10~3/ml,10~4 /ml ,10~5/ml ,10~6/ml四個組接種。各組均以懸浮培養(yǎng)第四天觀察到的EBs個數(shù)達高峰,以10~4/ml密度接種的那組EB最多為171.67±3.51個,與其它各組相比差異有顯著性(P0.05)。 4.維生素C誘導miPSc分化為心肌細胞的最佳濃度為10~(-4)mol/l,約為57.00±3.20%的EBs出現(xiàn)搏動,顯著高于不添加任何誘導劑的對照組5.13±0.55%(P0.01)。誘導而來的心肌細胞表達心肌特異性蛋白cTnT以及α-actin。 5.Percoll密度梯度離心法將誘導分化而來細胞分為了四層,以第三和第四層心肌細胞比例最高,分別為26±1%和60±2%,明顯多于第一層3±1%和第二層5±1%(P0.05)。分化而來的心肌細胞表達心肌特異性蛋白cTnT以及α-actin。 結論: 1.用維生素C作為誘導劑能顯著提高iPSc源的EBs分化為心肌細胞的效率; 3.利用Percoll密度梯度離心法可以將iPSc誘導而來的心肌細胞單獨分離出來。
[Abstract]:Aim: to investigate the effect of vitamin C as an inducer on the differentiation of mouse induced pluripotent stem cells (miPSc) into cardiomyocytes in vitro. Method 1: 1. MiPSc was resuscitated to identify its totipotency from cell morphology, expression of stem cell totipotent gene Oct-4 and alkaline phosphatase staining. To compare the effect of different attachment time on the number of regular embryoid body (EBs) formed by suspension method and the effect of different cell inoculation concentration on the number of regular EBs formed by direct suspension method. The morphological changes of EBs formed by miPSc in vitro were observed. 2. The effects of 10 ~ (-3) mol / L ~ (-4) mol / L ~ (-5) mol / L ~ (-10) ~ (-6) mol/l on the differentiation of EBs into cardiomyocytes were compared, and the specific proteins cTnT and 偽 -actin were identified. Cardiomyocytes derived from EBs were isolated and purified by Percoll density gradient centrifugation, and the myocardial specific proteins cTnT and 偽 -actin were identified. The result is 1: 1. Under the light microscope, iPSc grew like a bird's nest. Under the fluorescence microscope, the colony of iPSc produced green fluorescence (Oct-4 priming), and the result of alkaline phosphatase staining showed that the colony of iPSc was dark blue. 2. EBs were made by suspension and suspension two-step method. After 15 mins, 30mins, 60min, and 90min removed the feeding layer, the best effect was achieved with the ratio of regular EBs to 67.82 鹵5.10m, which was significantly different from that of other groups (P0.05). The results were as follows: (1) the rate of 60min was better than that of other groups (P < 0.05), and the rate of regular EBs was 67.82 鹵5.10% (P < 0.05). EBswere prepared by suspension one-step method, and the cell density was adjusted to 10 ~ 3 / ml ~ (10 ~ 4) / ml ~ (10 ~ 5) / ml ~ (10 ~ (6) / ml) inoculation in four groups. The number of EBs observed in each group reached the peak on the fourth day of suspension culture, and the maximum number of EB in the group inoculated with 10~4/ml density was 171.67 鹵3.51, which was significantly different from other groups (P0.05). The optimal concentration of vitamin C to induce miPSc differentiation into cardiomyocytes was 10 ~ (-4) mol / L, about 57.00 鹵3.20% EBs appeared pulsatility, which was significantly higher than that of the control group (5.13 鹵0.55%) without any inducer (P0.01). The induced cardiomyocytes expressed myocardial specific protein cTnT and 偽 -actin.5.Percoll density gradient centrifugation divided the induced differentiated cells into four layers, with the third and fourth layers being the highest. It was 26 鹵1% and 60 鹵2% respectively, which was significantly higher than that in the first layer (3 鹵1%) and the second layer (5 鹵1%) (P0.05). The differentiated cardiomyocytes express myocardial specific protein cTnT and 偽-actinin. Conclusion: 1. Vitamin C as inducer could significantly improve the differentiation efficiency of iPSc derived EBs into cardiomyocytes. 3. Isolated cardiomyocytes induced by iPSc could be isolated by Percoll density gradient centrifugation.
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

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本文編號：2069389