本文選題：EPEC + IntiminC280　； 參考：《川北醫(yī)學(xué)院》2012年碩士論文

【摘要】：背景： 致病性大腸桿菌（enteropathogenic Escherichia coli，EPEC）是引起發(fā)展中國家嬰幼兒腹瀉的重要病原體。EPEC致病標(biāo)志性的特點(diǎn)之一就是產(chǎn)生粘附脫落損傷（AE）。所有與AE損傷有關(guān)的基因片段均由染色體上一段長為35 kb的被稱為上皮細(xì)胞脫落基因座（LEE）的毒力島編碼。EPEC與宿主細(xì)胞最初的粘附是由EspA介導(dǎo)的,通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）的效應(yīng)分子易位到宿主細(xì)胞。緊密粘附由外膜蛋白緊密素intimin介導(dǎo)。IV型束狀菌毛（BFP）與微小菌落的形成有關(guān)，可以促進(jìn)細(xì)菌之間的相互作用，在志愿者參與的實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)是EPEC的毒力因子之一。目前國內(nèi)外有關(guān)EPEC的疫苗研究較少。本研究旨在通過基因重組的方法表達(dá)與EPEC毒力有關(guān)的三個(gè)致病因子的蛋白，通過親和層析的方法純化，為EPEC疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。 目的： （1）分別構(gòu)建致病性大腸桿菌intiminC280、bfpA和espA原核表達(dá)載體pQE30-intiminC280，pQE30-bfpA和pQE30-espA。 （2）觀察重組質(zhì)粒pQE30-intiminC280，pQE30-bfpA和pQE30-espA在M15中的蛋白表達(dá)情況； （3）檢測IntiminC280、BfpA和EspA蛋白的表達(dá)形式 （4）初步純化所表達(dá)的蛋白 方法： （1）分別設(shè)計(jì)三對(duì)引物，，用PCR方法擴(kuò)增EPEC O127:H6的三個(gè)致病基因intiminC280、bfpA和espA，測定序列的正確性。 （2）將擴(kuò)增的三個(gè)目的基因片段通過基因重組到原核表達(dá)載體pQE30中,并轉(zhuǎn)化至M15中。 （3）用IPTG誘導(dǎo)含有重組質(zhì)粒的M15使其表達(dá)相應(yīng)蛋白。 （4）SDS-PAGE檢測誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白的存在形式 （5）用親和層析的方法初步純化以包涵體形式存在的蛋白。 結(jié)果： （1）成功構(gòu)建致病性大腸桿菌pQE30/intiminC280、pQE30/bfpA和pQE30/espA原核表達(dá)載體 （2）成功表達(dá)IntiminC280和EspA，但BfpA未見表達(dá)； （3）IntiminC280和EspA的蛋白表達(dá)形式有包涵體和可溶性表達(dá)； （4）成功純化了IntiminC280和EspA以包涵體形式表達(dá)的蛋白。 結(jié)論： （1）IntiminC280和EspA屬于外膜蛋白，易于建立原核表達(dá)系統(tǒng)。 （2）BfpA屬于跨膜蛋白，重組質(zhì)粒易于構(gòu)建，但表達(dá)的條件仍有待進(jìn)一步研究。 （3）用親和層析的方法可純化含有組氨酸標(biāo)簽的重組IntiminC280和EspA蛋白。
[Abstract]:Background: pathogenic E. coli enterogenic Escherichia coli (EPEC) is one of the most important pathogens of infantile diarrhea in developing countries. All the gene fragments associated with AE damage were encoded by a virulence island of 35 kb on the chromosome called epithelial cell exfoliative gene locus (LEE). The initial adhesion of EPEC to host cells was mediated by EspA. The effector molecules of type 鈪

本文編號(hào)：2033533