本文選題：脊髓側(cè)角 + 乙酰膽堿酯酶��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：目的：肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一種病因未明神經(jīng)系統(tǒng)變性病，選擇性損傷大腦皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)核神經(jīng)元、脊髓前角a運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，導(dǎo)致進(jìn)行性加重的肌肉無力、萎縮，最終因呼吸肌麻痹死亡。近年來研究發(fā)現(xiàn)部分ALS患者存在自主神經(jīng)系統(tǒng)、錐體外系系統(tǒng)、感覺系統(tǒng)等非運(yùn)動(dòng)神經(jīng)區(qū)域受累的癥狀，提示ALS可能是一個(gè)多系統(tǒng)累及的神經(jīng)變性疾病。Murata Y發(fā)現(xiàn)ALS伴發(fā)晝夜血壓的變化,血壓與心率之間的相關(guān)性的降低，嚴(yán)重可誘發(fā)循環(huán)衰竭、心律失常乃至猝死[1]；及其他自主神經(jīng)異常的表現(xiàn)如：排汗增加及減少[2]、唾液分泌減少[3]、胃排空時(shí)間延長(zhǎng)[4]等改變。 Takahashi H及Kennedy PG分別報(bào)道ALS患者胸髓中間外側(cè)核神經(jīng)元的丟失[5-6],Itoh T發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元免疫活性的改變[7]及Kihira T也在萎縮神經(jīng)元胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)了包涵體[8]，比如Onuf,s核的bunnia小體。在SOD1(V118L)基因突變的家族型ALS患者短期內(nèi)出現(xiàn)自主神經(jīng)衰竭，尸檢發(fā)現(xiàn)延髓自主神經(jīng)核及中間外側(cè)柱明顯的神經(jīng)元丟失[9]。對(duì)SOD1~(G93A)轉(zhuǎn)基因小鼠研究發(fā)現(xiàn)安靜狀態(tài)下早期轉(zhuǎn)基因鼠心率增高，提示疾病早期自主神經(jīng)功能損傷[10]。 交感神經(jīng)的低級(jí)中樞位于脊髓胸1（T1）至腰2-腰3（L2或L3），組成了中間外側(cè)柱(IML)，在調(diào)節(jié)自主神經(jīng)功能方面具有重要作用。 本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用甲苯胺藍(lán)染色及免疫組化的方法，觀察家族型肌萎縮側(cè)索硬化動(dòng)物模型（SOD1~(G93A)轉(zhuǎn)基因小鼠）病程不同階段脊髓側(cè)角神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)及乙酰膽堿酯酶的表達(dá)情況，旨在探討脊髓側(cè)角神經(jīng)元在ALS的發(fā)病過程的變化特征，為ALS發(fā)病機(jī)制研究提供一定的理論基礎(chǔ)。 方法： 1模型建立及分組 飼養(yǎng)繁殖家族型肌萎縮側(cè)索硬化動(dòng)物模型SOD1~(G93A)轉(zhuǎn)基因小鼠，參考Vercelli A[11]等的1-5分評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分,4分為發(fā)病時(shí)間，1分為死亡時(shí)間,60天為癥狀前期，4分為癥狀早期，1分為終末期。各對(duì)照組為同窩、同月齡未轉(zhuǎn)人突變的SOD1基因的小鼠。每組各3只小鼠。 2取材 10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，心臟灌注4%多聚甲醛固定20min，取小鼠脊髓胸段將其分成上段（T1-T3）、中段（T4-T6）、下段（T7-T9），分別以4%多聚甲醛固定48h。 3甲苯胺藍(lán)染色 后固定的組織塊經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)組織切5μm片，進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色。依據(jù)Oppenheimer定量組織學(xué)方法[12]，計(jì)數(shù)脊髓側(cè)角神經(jīng)元。 4免疫組化染色 10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，心臟灌注4%多聚甲醛固定30min，取小鼠脊髓胸段將其分成上胸髓（T1-T3）、中胸髓（T4-T6）、下胸髓（T7-T9），分別以4%多聚甲醛固定12小時(shí)，震蕩切片25μm厚，應(yīng)用乙酰膽堿酯酶進(jìn)行免疫組化染色。 5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示上段（T1-T3）、中段（T4-T6）、下段（T7-T9）各脊髓切片兩側(cè)神經(jīng)元計(jì)數(shù)之和，三組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)的比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本比較的t檢驗(yàn)，，以a=0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果： 1模型建立 B6SJL-BTg（SOD1~(G93A)）1Gur/J半合子雄鼠與B6SJLF1/J+/+雌鼠1:1雜交，在恒溫、恒濕、12h光照/黑暗交替循環(huán)、無特殊病原菌的（Specificpathogen free， SPF）環(huán)境中，喂以滅菌的SPF級(jí)顆粒型鼠類飼料及滅菌水，經(jīng)剪尾尖提取DNA、PCR擴(kuò)增后、瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果示（Fig.1）：位于200-300bp之間的條帶（236bp）為mSOD1的PCR產(chǎn)物，此種小鼠為SOD1~(G93A)轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。沒有此條帶為非mSOD1的PCR產(chǎn)物，為非SOD1~(G93A)轉(zhuǎn)基因鼠。 2甲苯胺藍(lán)染色 2.1上胸髓（T1-T3） 癥狀前期、發(fā)病期、終末期SOD1~(G93A)轉(zhuǎn)基因小鼠中神經(jīng)元計(jì)數(shù)分別為7.4±3.0、7.0±2.0、3.7±1.5，對(duì)照組分別為5.3±1.9、4.1±1.2、6.1±1.9，癥狀前期和發(fā)病期期較終末期比較均有顯著性差別（P0.05）。發(fā)病期及終末期神經(jīng)元計(jì)數(shù)較對(duì)照組有顯著性差別（P0.05）。癥狀前期及發(fā)病期轉(zhuǎn)基因鼠神經(jīng)元大致正常，終末期神經(jīng)元變性。 2.2中胸髓（T4-T6） SOD1~(G93A)轉(zhuǎn)基因小鼠癥狀前期、發(fā)病期、終末期神經(jīng)元計(jì)數(shù)分別為4.5±1.6、4.3±1.5、2.5±1.2，總體均數(shù)比較P=0.01(0.05）差別無顯著性意義。對(duì)照組分別為4.1±2.0、4.5±2.0、5.5±1.6，終末期SOD1~(G93A)轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元細(xì)胞計(jì)數(shù)較對(duì)照組有顯著性差別（P0.05）。癥狀前期及發(fā)病期轉(zhuǎn)基因鼠神經(jīng)元大致正常，終末期神經(jīng)元變性。 2.3下胸髓（T7-T9） SOD1~(G93A)轉(zhuǎn)基因小鼠在癥狀前期、發(fā)病期、終末期神經(jīng)元計(jì)數(shù)分別為4.4±1.6、5.0±1.8、2.4±0.8，對(duì)照組分別為5.0±2.0、4.4±1.2、5.5±1.6，癥狀前期和發(fā)病期較終末期比較均有顯著性差別（P0.05）。終末期SOD1~(G93A)轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元細(xì)胞計(jì)數(shù)較對(duì)照組有顯著性差別（P0.05）。癥狀前期及發(fā)病期轉(zhuǎn)基因鼠神經(jīng)元大致正常，終末期神經(jīng)元變性。 3免疫組化染色 3.1上胸髓（T1-T3） SOD1~(G93A)轉(zhuǎn)基因小鼠癥狀前期、發(fā)病期、終末期神經(jīng)元計(jì)數(shù)分別為6.5±1.2、6.0±2.0、3.7±1.2，對(duì)照組分別為5.8±1.9、7.8±1.5、5.0±1.0，癥狀前期和發(fā)病期較終末期比較均有差別（P0.05）。發(fā)病期神經(jīng)元細(xì)胞計(jì)數(shù)較對(duì)照組有顯著性差別（P0.05）。癥狀前期及發(fā)病期神經(jīng)元包漿呈深褐色，胞核無色，成多邊形。終末期神經(jīng)元變性，著色變淡。 3.2中胸髓（T4-T6） SOD1~(G93A)轉(zhuǎn)基因小鼠癥狀前期、發(fā)病期、終末期神經(jīng)元計(jì)數(shù)分別為6.6±2.6、4.9±2.0、3.0±1.4，癥狀前期和發(fā)病期與終末比較均有差別（P0.05）。對(duì)照組分別為4.8±1.0、5.5±0.6、5.8±1.0，終末期神經(jīng)元細(xì)胞計(jì)數(shù)較對(duì)照組有顯著性差別（P0.05）。癥狀前期及發(fā)病期神經(jīng)元包漿呈深褐色，胞核無色，成多邊形。終末期神經(jīng)元變性，著色變淡。 3.3下胸髓（T7-T9） SOD1~(G93A)轉(zhuǎn)基因小鼠癥狀前期、發(fā)病期、終末期神經(jīng)元計(jì)數(shù)分別為6.7±1.8、6.3±2.6、3.0±1.0，總體均數(shù)比較P=0.059(0.05）差別無顯著性意義,對(duì)照組分別為5.3±1.2、5.3±1.5、5.0±0.0，終末期神經(jīng)元細(xì)胞計(jì)數(shù)較對(duì)照組有顯著性差別（P0.05）。癥狀前期及發(fā)病期神經(jīng)元包漿呈深褐色，胞核無色，成多邊形。終末期神經(jīng)元變性，著色變淡。 結(jié)論：在SOD1轉(zhuǎn)基因鼠發(fā)病過程中，存在脊髓側(cè)角神經(jīng)元丟失，尤其是在疾病的終末期，上、中、下胸髓節(jié)段間無明顯差異。
[Abstract]:Objective: amyotrophic lateral sclerosis (amyotrophic lateral sclerosis, ALS) is a pathogeny unknown neurodegenerative disease, selectively damaging the cerebral cortex motoneurons, brainstem motor neurons, and a motoneurons in the anterior horn of the spinal cord, causing progressive muscle weakness, atrophy, and final death due to respiratory muscle paralysis. Recent research It was found that some ALS patients had the symptoms of the autonomic nervous system, extrapyramidal system, sensory system and other non motor nerve regions, suggesting that ALS may be a multi system neurodegenerative disease,.Murata Y found the changes in the circadian blood pressure in ALS, the correlation between blood pressure and heart rate decreased, and the circulation failure could be induced seriously. Arrhythmia and even sudden death [1], and other abnormalities of autonomic nerve, such as increased perspiration and reduction of [2], saliva secretion reduced [3], gastric emptying time extended [4] and other changes.
Takahashi H and Kennedy PG reported the loss of [5-6] in the middle lateral nucleus of the thoracic spinal cord of the patients with ALS, Itoh T found the changes in the immune activity of the neurons and the Kihira T also found the inclusion body [8] in the cytoplasm of the atrophic neurons. SOD1~ (G93A) transgenic mice have been found to have a significant loss of [9]. in the nucleus of the medulla oblongata and the medial lateral column. It is found that the heart rate of the early transgenic mice is higher in the quiet state, suggesting that the early autonomic nervous function damage of the disease is [10]..
The low-level center of the sympathetic nerve is located in the spinal thoracic 1 (T1) to the lumbar 2- waist 3 (L2 or L3), which constitutes the middle lateral column (IML), which plays an important role in regulating the function of the autonomic nerve.
In this experiment, we intend to use toluidine blue staining and immunohistochemical method to observe the structure of spinal cord neurons and the expression of acetylcholinesterase in the spinal cord side angle of SOD1~ (G93A) transgenic mice. The aim of this study is to explore the characteristics of the changes of the spinal cord neurons in the pathogenesis of ALS, which is ALS The study of pathogenesis provides a theoretical basis.
Method錛

本文編號(hào)：2015698