本文選題：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 + 生殖細(xì)胞�。� 參考：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一種具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞,體內(nèi)外可以分化為成骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。目前關(guān)于人和小鼠BMSCs的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)已經(jīng)有大量報(bào)道,但關(guān)于奶山羊BMSCs報(bào)道很少,尤其是奶山羊BMSCs分化為生殖細(xì)胞的研究相對較少。山羊作為重要的經(jīng)濟(jì)動物,具有生產(chǎn)肉、絨、奶等經(jīng)濟(jì)價值,而且奶山羊養(yǎng)殖業(yè)是我國的優(yōu)勢畜牧產(chǎn)業(yè)之一,所以,利用干細(xì)胞作為種子細(xì)胞開展奶山羊的遺傳育種以及轉(zhuǎn)基因克隆的研究可能是加速優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶山羊擴(kuò)繁的捷徑之一。為了進(jìn)一步為奶山羊細(xì)胞發(fā)育分化、育種及動物疾病模型等研究提供材料,我們開展了以下的試驗(yàn)工作。 1.采用貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行BMSCs的分離和培養(yǎng),通過形態(tài)學(xué)觀察、生長曲線測定、免疫細(xì)胞化學(xué)、流式分析、RT-PCR技術(shù)等進(jìn)行檢測;免疫細(xì)胞化學(xué)法對自發(fā)分化的細(xì)胞及定向誘導(dǎo)分化的神經(jīng)樣細(xì)胞、心肌樣細(xì)胞、生殖樣細(xì)胞進(jìn)行檢測,并計(jì)算生殖樣細(xì)胞的陽性率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明分離的奶山羊BMSCs為成纖維樣細(xì)胞,增殖能力強(qiáng);其表達(dá)MSCs和胚胎干細(xì)胞(ESCs)的表面標(biāo)記如OCT4、Nanog、C-Myc和TERT,細(xì)胞表面標(biāo)記CD29、CD44、CD166呈陽性,CD71、CD45、CD34呈陰性;將該細(xì)胞制作成類胚體,經(jīng)自發(fā)分化后表達(dá)三胚層標(biāo)志基因:AFP、NSE、β-ⅢTubulin和心肌α-actin;經(jīng)化學(xué)試劑誘導(dǎo),定向分化為表達(dá)β-ⅢTubulin的早期神經(jīng)樣細(xì)胞;表達(dá)CT3及心肌α-actin的心肌樣細(xì)胞,出現(xiàn)肌管樣細(xì)胞;表達(dá)生殖細(xì)胞特異性蛋白VASA、SCP3和CD49f(α6整合素),其陽性率分別達(dá)到35.7 %,24 %和14 %。結(jié)果表明所分離培養(yǎng)的BMSCs具備間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性,可以為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 2.用不同轉(zhuǎn)染體系篩選針對BMSCs的最佳轉(zhuǎn)染條件。根據(jù)Fugene?HD轉(zhuǎn)染試劑,Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑, Lipofectamine? 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染結(jié)果證明,Lipofectamine? 2000轉(zhuǎn)染效率較好,達(dá)44.88 %;不同電壓模式:400 V/450 V/500 V/550/650 V/750 V,脈沖時間:3 S;脈沖次數(shù):3次,脈沖間隔:1 min進(jìn)行細(xì)胞電轉(zhuǎn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低壓(U500 V)情況下,電壓愈高,存活細(xì)胞愈少;高壓(U500 V)情況下不穩(wěn)定。高壓情況下利于細(xì)胞轉(zhuǎn)染,最高達(dá)26.94 %,但細(xì)胞容易分化。綜合電轉(zhuǎn)和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的結(jié)果,后期轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine? 2000進(jìn)行BMSCs的pStra8-EGFP轉(zhuǎn)染(BMSCs-Stra8)。 3.采用Lipofectamine? 2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞后利用不同的誘導(dǎo)體系,包括RA、睪丸提取液(GE)及組合誘導(dǎo)液(RA+GE)誘導(dǎo),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與組合誘導(dǎo)、GE誘導(dǎo)相比,誘導(dǎo)7 d后,RA誘導(dǎo)組表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)量和免疫組化染色表達(dá)Stra8的陽性細(xì)胞數(shù)量呈極顯著差異。利用RA單層誘導(dǎo),誘導(dǎo)第5 d時觀察到圓形GFP細(xì)胞,后期誘導(dǎo)細(xì)胞消失,此后不斷有圓形細(xì)胞出現(xiàn),在誘導(dǎo)14 d時出現(xiàn)了精子樣細(xì)胞。轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)Stra8和Prm1,蛋白水平上表達(dá)GFRα-1, Stra8, VASA, SCP3, DAZL, ACR,細(xì)胞周期分析與山羊的精原細(xì)胞相似,說明體外誘導(dǎo)BMSCs能夠分化為精原細(xì)胞,并可能向減數(shù)分裂后期發(fā)育。 4.制作生精缺陷模型鼠25只,采用曲細(xì)精管注射方法將BMSCs注射于生精缺陷模型鼠睪丸,在移植15 d,30 d,90 d時,脫頸致死小鼠,取出雙側(cè)睪丸,分別對治療側(cè)和未治療側(cè)的睪丸、附睪稱重,比較兩側(cè)睪丸各級生精細(xì)胞發(fā)育和曲細(xì)精管萎縮程度等,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明BMSCs移植30 d后能夠明顯促進(jìn)生精缺陷模型小鼠睪丸生殖細(xì)胞的發(fā)育和分化。將BMSCs用CM-DIL(氯甲基苯甲酰胺)標(biāo)記后采用曲細(xì)精管注射生精缺陷模型小鼠睪丸,移植30 d時免疫熒光染色觀察,移植細(xì)胞定位于曲細(xì)精管的基底膜部,且表達(dá)PCNA, Stra8, GFRα-1(不表達(dá)ACR),說明異體移植BMSCs具有分化為生殖細(xì)胞的潛能。
[Abstract]:Bone marrow mesenchymal stem cells ( MSCs ) are a kind of adult stem cells with multi - directional differentiation potential , which can differentiate into osteoblasts , muscle cells , chondrocytes , nerve cells , etc .

1 . Separation and culture of bone marrow cells were carried out by adherent culture . The results showed that the isolated milk goats were detected by means of morphological observation , growth curve determination , immune cell chemistry , flow analysis , RT - PCR technique and so on . The results showed that the isolated milk goats were made into fibroid cells , and the positive rates of CD29 , CD44 and CD166 were detected . The results showed that the isolated cultured bone marrow cells had the biological characteristics of mesenchymal stem cells , which could lay the foundation for further experiments .

2 . The transfection efficiency of Lipofectamine 2000 transfection reagent , Lipofectamine 2000 transfection reagent and Lipofectamine 2000 transfection reagent showed that the transfection efficiency of Lipofectamine 2000 was better than that under high voltage ( U500 V ) .

3 . After transfection of cells with Lipofectamine 2000 , different induction systems were used , including RA , testis extract ( GE ) and combination - induced liquid ( RA + GE ) . The results showed that the number of cells expressing GFP in RA - induced group was significantly different from that in combination - induced and GE - induced .

4 . Twenty - five mice were injected into the rat testis of spermatogenic defect model mice by the injection method of fine tube . The results showed that after 30 days of transplantation , the development and differentiation of spermatogenic cells and the atrophy of spermatogenic cells were observed . The experimental results showed that the transplanted cells were located in the basement membrane of the fine tube and the PCNA , Stra8 and GFR 偽 - 1 ( not expressed ACR ) were injected into the basal membrane of the tubules .
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

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本文編號：1998286