本文選題：漢坦病毒 + 進化　； 參考：《武漢大學》2012年博士論文

【摘要】：目的： 研究近年來流行在湖北地區(qū)的漢坦病毒的基因特征,并構建不同型別漢坦病毒假病毒,從而為進一步研究漢坦病毒G蛋白的功能提供新的手段。 方法： 1.湖北江夏地區(qū)鼠肺標本、HFRS患者血清的收集及篩選：獲取2009-2011年間江夏區(qū)的6個采樣點(胡家村、姚家灣、段嶺廟、敖家邊、山坡和張家灣)的鼠肺標本；并收集2009-2011年間江夏區(qū)臨床診斷為腎綜合征出血熱(HFRS)的患者血清標本。利用間接免疫熒光(IFA),空斑減數(shù)中和實驗(FRNT)以及RT-PCR對收集的樣本進行篩選。 2.用RT-PCR法對病毒基因進行擴增,PCR產(chǎn)物克隆并測序,用MEGA等生物學軟件對病毒的部分S片段進行系統(tǒng)進化分析。了解江夏區(qū)漢坦病毒流行的型別、基因特征。 3.采用漢坦病毒感染乳BALB/c小鼠,對陽性標本進行病毒分離、傳代,獲得病毒株。并進行全基因組測序,用生物學軟件分析其基因組特征。 4.利用VSV△G-GFP (Luciferase)骨架分別構建含無名病毒(SNV),安第斯病毒(ANDV),漢灘病毒(HTNV)以及希望山病毒(PHV)的漢坦病毒假病毒,并對其感染性進行研究。 5.用相應的HFRS/HPS抗血清,單克隆抗體等對這些漢坦病毒假病毒的抗原性進行研究。同時用受體特異性的抑制劑與其作用,觀察假病毒進入細胞的方式,并與漢坦病毒原型分離株進行比較。 6.構建致病性(SNV)和非致病性(PHV)嵌和G蛋白的漢坦病毒假病毒(即：SNVGn與PHVGc組合形成嵌和G蛋白,PHVGn與SNV Gc組合形成嵌合G蛋白)。并用漢坦病毒肺綜合征(HPS)病人的抗血清與之反應檢測其抗原性。 7.用抗體與HV004G蛋白構建的漢坦病毒假病毒反應,然后用流式細胞儀檢測。另外用阿比朵爾作用Vero-E6細胞后,再加入假病毒,觀察其抑制效果。 結果： 1.捕獲動物的帶毒率及血清陽性率：共捕獲173只動物,包括黑線姬鼠48只,褐家鼠125只,從3只褐家鼠和4只黑線姬鼠中檢測到了漢坦病毒核酸,鼠肺標本中漢坦病毒核酸總檢出率為4.05%。同時收集到11份HFRS病人血清,從其中的10份檢測到了HTNV或SEOV中和抗體(有2份檢測出漢坦病毒核酸)。 2.所有漢坦病毒陽性標本部分S片段的測序結果：江夏地區(qū)鼠間流行漢坦病毒為HTNV和SEOV型,進化分析顯示,來自褐家鼠的漢坦病毒基因序列(JX1143、JX0937、JX1018和JX1028)與SEOV (Z37、ZT10株等)形成一簇,屬于SEOV型。從黑線姬鼠中擴增出的漢坦病毒序列(HV003、HV004和HV005)和兩個從HFRS病人中得到的病毒序列(s200903和s201012),屬于HTNV型,組成一個新的分枝。 3.對分離得到的HV004株全基因組測序結果顯示：HV004屬于HTNV型漢坦病毒,其全基因序列與其它HTNV (76-118, A9, CGHu2, CGRn45, Q32株等)比較,核酸的同源性為83%-90%,推導出氨基酸的同源性為95%-99%。對S,M和L全序列分析均表明HV004株為一個獨立的分枝。在分離過程中,經(jīng)BALB/c乳鼠傳3代后,僅在S片段3’非編碼區(qū)有一處發(fā)生了堿基突變,但其致病性沒有變化。 4.VSV-G假病毒的滴度從(?)3X105IU/ml (VSV△G-ANDV-GFP)到2×107IU/ml(VSV△G-VSV-GFP)。 VSV G-luc(?)段病毒顆粒與野生的VSV一樣有著彈狀外形,VSV△G-luc-HTNV平均長度為163.7±10.7nm,平均寬度為71.1±6.6nm。其它型別的假病毒大小與VSV A G-luc-HTNV.相似。 5.用抗?jié)h灘型漢坦病毒的單克隆抗體(即抗Gc特異性單克隆抗體HCO2和11E10),抗VSV單克隆抗體mAb VSV,及SNV, ANDV和HTNV抗血清,分別與對應的漢坦病毒假病毒和原型分離株漢坦病毒反應,同一種抗體對兩種病毒表現(xiàn)出相似的抑制效果。 6.抗SNV血清可以中和嵌合假病毒,對兩個嵌合的假病毒的中和作用介于抗SNV和PHV假病毒之間。另外抗SNV血清對PHVMSNV中和作用比SNVMPHV稍強。 7. ReoPro可以同時減少致病性漢坦病毒和相對應的漢坦病毒假病毒進入Vero-E6細胞,紫外滅活的SNV和HTNV可以分別抑制SNV和HTNV假病毒進入細胞。 8.阿比朵爾可以特異性抑制漢坦病毒假病毒進入細胞�？梢杂昧魇郊毎麅x對HV004假病毒感染細胞后進行檢測,從而有望用于高通量藥物篩選。 結論： 1.湖北HFRS疫區(qū)流行一種新亞型HTNV,其很有可能是引起近年來HFRS流行的病原體。 2.漢坦病毒假病毒在抗原特征以及進入細胞方式上與原型分離株病毒相似,這為進一步研究漢坦病毒包膜蛋白與細胞的相互作用、病毒趨向性的研究以及應用于抗?jié)h坦病毒藥物的篩選提供了新的手段。
[Abstract]:Objective:
The study of hantavirus gene characteristics in Hubei area in recent years, and the construction of different hantavirus pseudo virus, thus provide a new way to further study the function of hantavirus G protein.
Method錛，

本文編號：1998198