本文選題：分子嵌合 + MHC-I　； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：目的：構(gòu)建分子嵌合MHC-I基因小鼠骨髓前體T細(xì)胞,探討其預(yù)輸注受體降低受體小鼠對(duì)供體小鼠來(lái)源T細(xì)胞刺激反應(yīng)能力的影響,為研究分子嵌合誘導(dǎo)移植免疫耐受打下基礎(chǔ)。 方法：采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)獲取C57BL/6小鼠MHC-I等位基因H-2Db和H-2Kb,分別將其連入質(zhì)粒pIRES,構(gòu)建pIRES-H-2Db、 pIRES-H-2Kb質(zhì)粒,雙酶切電泳檢測(cè)和測(cè)序鑒定插入序列。培養(yǎng)BALB/c小鼠骨髓造血干細(xì)胞,細(xì)胞因子IL-3和SCF誘導(dǎo)分化,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)前體T細(xì)胞(pre-T細(xì)胞)表面標(biāo)志Thy-1.2+、CD3-。脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染C57BL/6小鼠MHC-I等位基因H-2Db和H-2Kb入BALB/c小鼠pre-T細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BALB/c小鼠pre-T細(xì)胞H-2Db和H-2Kb蛋白的表達(dá)。將轉(zhuǎn)染C57BL/6小鼠MHC-I等位基因的BALB/c小鼠pre-T細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射回BALB/c小鼠,飼養(yǎng)7天后取其脾細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞,用C57BI/6小鼠的脾細(xì)胞做刺激細(xì)胞,單向混合淋巴細(xì) 胞培養(yǎng),改良MTT法檢測(cè)其增殖效果。結(jié)果：①成功獲取C57BL/6小鼠MHC-I等位基因H-2Db和H-2Kb,構(gòu)建質(zhì)粒pIRES-H-2Db和pIRES-H-2Kb,雙酶切鑒定插入序列大小正確,并經(jīng)測(cè)序與Genbank上H-2Db和H-2Kb序列完全一致。②成功體外培養(yǎng)BALB/c小鼠骨髓pre-T細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Thy-1.2+、CD3-細(xì)胞的比例可達(dá)64.8%。③脂質(zhì)體成功轉(zhuǎn)染C57BL/6小鼠MHC-I等位基因H-2Db,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H-2Db蛋白表達(dá)為14.6%,與未轉(zhuǎn)染組(0.1%)和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組(0.3%)相比有明顯升高(p0.05)；轉(zhuǎn)染C57BL/6小鼠MHC-I等位基因H-2Kb,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H-2Kb蛋白表達(dá)為14.8%,與未轉(zhuǎn)染組(0.1%)和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組(0.3%)相比亦有明顯升高(p0.05)。④單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)顯示,共注射組的刺激指數(shù)(SI)(0.764±0.074)比空質(zhì)粒組SI(0.983±0.081)和未轉(zhuǎn)染組S1(0.994±0.142)明顯下降(P0.01)；共注射組與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES-H-2Db組(0.859±0.085)、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES-H-2Kb (0.860±0.097)相比,SI值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)；轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES-H-2Db組、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES-H-2Kb組與未注射組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組分別比較,差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),而未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的S1值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(O0.05)。 結(jié)論：①成功構(gòu)建C57BL/6小鼠MHC-I等位基因H-2Db和H-2Kb真核表達(dá)質(zhì)粒。②細(xì)胞因子誘導(dǎo)可體外收獲BALB/c小鼠骨髓pre-T細(xì)胞。③C57BL/6小鼠MHC-I等位基因H-2Db和H-2Kb成功體外轉(zhuǎn)染至BALB/c小鼠pre-T細(xì)胞,且轉(zhuǎn)染后可穩(wěn)定表達(dá)。④體外成功獲得分子嵌合MHC-I等位基因受體小鼠pre-T細(xì)胞,其能降低受體對(duì)異基因供體來(lái)源T細(xì)胞刺激的反應(yīng)能力。
[Abstract]:Aim: to construct precursor T cells from bone marrow of mice with molecular chimeric MHC-I gene, and to investigate the effect of preinfusion receptor on the stimulating response of donor mice to T cells derived from donor mice, so as to lay a foundation for the study of molecular chimerism in inducing transplantation immune tolerance. Methods: the MHC-I alleles H-2Db and H-2Kb of C57BL/6 mice were obtained by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) technique. The plasmid pIRES-H-2Db, pIRES-H-2Kb was constructed, and the inserted sequence was identified by double digestion electrophoresis and sequencing. Bone marrow hematopoietic stem cells of BALB/c mice were cultured and differentiation was induced by cytokines IL-3 and SCF. The surface marker Thy-1.2 CD3-was detected by flow cytometry. The MHC-I allele H-2Db and H-2Kb of C57BL/6 mice were transfected into pre-T cells of BALB/c mice by liposome respectively. The expression of H-2Db and H-2Kb in pre-T cells of BALB/c mice was detected by flow cytometry. The pre-T cells of BALB/c mice transfected with MHC-I allele of C57BL/6 mice were injected into the tail vein of BALB/c mice. The spleen cells of BALB/c mice were taken as reaction cells after feeding for 7 days. The splenocytes of C57BI/6 mice were used as stimulators and mixed lymphoid fine cells in one way. Cell culture and modified MTT method were used to detect the proliferation effect. Results the MHC-I alleles H-2Db and H-2Kb of C57BL/6 mice were successfully obtained at 1: 1. The plasmids pIRES-H-2Db and pIRES-H-2Kb were constructed. The size of the inserted sequences was confirmed by double enzyme digestion, and the pre-T cells of BALB/c mice bone marrow were successfully cultured in vitro by sequencing with H-2Db and H-2Kb sequences on Genbank. The MHC-I allele H-2Db of C57BL/6 mice was successfully transfected with liposome 64.8.3 by flow cytometry, and the expression of H-2Db protein by flow cytometry was 14.6%, which was significantly higher than that of untransfected group (0.1%) and empty plasmid group (0.3%). The MHC-I allele H-2Kb was transfected into C57BL/6 mice, and the expression of H-2Kb protein was detected by flow cytometry. Compared with the control group (0.1%) and the empty plasmid group (0.3%), the expression of H-2Kb protein was also significantly increased in unidirectional mixed lymphocyte culture. The stimulation index (SI) of the co-injection group was 0.764 鹵0.074) significantly lower than that of the blank plasmid group (SI(0.983 鹵0.081) and the untransfected group (S 1N 0.994 鹵0.142), and the SI value of the co-injection group and the transfected plasmid pIRES-H-2Db group was 0.859 鹵0.085 and 0.860 鹵0.097, respectively, and the SI value of the transfected plasmid pIRES-H-2Db group was significantly higher than that of the control group. Compared with the control group and the blank plasmid group, the difference was also significant (p 0.05), but there was no significant difference in S1 value between the untransfected group and the empty plasmid group. Conclusion the successful construction of H-2Db and H-2Kb eukaryotic expression plasmids of MHC-I alleles H-2Db and H-2Kb in C57BL/6 mice can induce the successful transfection of MHC-I alleles H-2Db and H-2Kb into BALB/c mouse pre-T cells in vitro, and the MHC-I allele H-2Db and H-2Kb of BALB/c mouse bone marrow pre-T cells can be harvested in vitro. After transfection, the mouse pre-T cells with chimeric MHC-I alleles were successfully obtained after transfection, which could reduce the ability of the receptor to respond to the stimulation of allogeneic donor derived T cells.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1964259