本文選題：鼠疫菌 + YopE　； 參考：《天津大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：YopE是鼠疫菌六種分泌蛋白之一，在鼠疫的致病過(guò)程中起重要作用。在宿主細(xì)胞內(nèi)，YopE作為GTP水解酶，通過(guò)其144位 精氨酸手指‖結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜藕聯(lián)蛋白R(shí)hoGTP酶相互作用使該酶由活性狀態(tài)轉(zhuǎn)化為非活性狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞骨架蛋白actin的降解，使感染細(xì)胞受損。如果將其144位的精氨酸突變?yōu)楸彼幔╕opE(R144A)）則YopE不具有GAP活性。 核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB （Nuclear factor-κB）是響應(yīng)環(huán)境變化的一個(gè)至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，是進(jìn)化上高度保守的信號(hào)模塊，廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。在許多生物過(guò)程，如機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞分化與凋亡及其他應(yīng)激反應(yīng)等，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。 本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)酵母雙雜交篩庫(kù)及陣列篩選發(fā)現(xiàn)YopE與p65存在相互作用，提示YopE與p65的相互作用可能在鼠疫菌的感染過(guò)程中起重要的作用。本研究通過(guò)免疫共沉淀，，GST-Pull Down實(shí)驗(yàn)證明YopE與p65確實(shí)存在相互作用。GST-Pull Down實(shí)驗(yàn)確定YopE與p65的相互作用結(jié)構(gòu)域?yàn)閅opE(1-49aa、88-99aa)和p65(201-312aa)，其中YopE的88-99肽段在與p65的相互作用中起重要作用。報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明，轉(zhuǎn)染早期YopE以不依賴GAP活性方式顯著激活NF-κB通路。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)YopE能促進(jìn)p65入核。表達(dá)YopE上調(diào)NF-κB下游靶基因，其中明顯上調(diào)NF-κB下游的抗凋亡和炎癥反應(yīng)基因。抑制NF-κB通路增加YopE誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。機(jī)制上，我們發(fā)現(xiàn)YopE能明顯促進(jìn)p65與IκBα的解離。本文同時(shí)還構(gòu)建了YopE/YopE(R144A)的可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，并用該系統(tǒng)驗(yàn)證了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 此外，本文還采用可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)研究了YopE/YopE(R144A)對(duì)HeLa細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。發(fā)現(xiàn)YopE明顯抑制Rosup所引起的細(xì)胞ROS產(chǎn)生、阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)p21蛋白表達(dá)。 綜上，本研究發(fā)現(xiàn)YopE通過(guò)與p65的相互作用促進(jìn)NF-κB活化，并提高細(xì)胞的存活能力，可能在鼠疫菌早期的感染過(guò)程中起到重要的作用。
[Abstract]:YopE is one of the six secretory proteins of Yersinia pestis, which plays an important role in the pathogenesis of Yersinia pestis. In host cells, Yope E was used as a GTP hydrolase. Through the interaction between its 144-arginine finger structure and RhoGTP enzyme of cell membrane, the enzyme changed from active state to inactive state, leading to the degradation of cytoskeletal protein actin. Damage infected cells. If the arginine at position 144 was mutated to Yop EJ R144A), YopE did not have GAP activity. Nuclear factor- 魏 B (NF- 魏 B) is an important transcription factor in response to environmental changes. It is a highly conserved signal module in evolution and widely exists in mammalian cells. In many biological processes, such as inflammation, immune response, cell differentiation and apoptosis, and other stress reactions, play a crucial role. The interaction between YopE and p65 was found by yeast two-hybrid sieve library and array screening in our laboratory, suggesting that the interaction between YopE and p65 may play an important role in the infection of Yersinia pestis. In this study, the interaction between YopE and p65 was confirmed by immunoprecipitation GST-Pull Down assay. GST-Pull Down assay confirmed that the interaction domains of YopE and p65 were YopE ~ (1-49aA) ~ (88-99aa) and p ~ (65) -201-312aaa ~ (a). The 88-99 peptide of YopE played an important role in the interaction with p65. The reporter gene experiment showed that the NF- 魏 B pathway was significantly activated by YopE transfection in a manner independent of GAP activity. Indirect immunofluorescence assay showed that YopE could promote p65 entry. The expression of YopE up-regulated the downstream target gene of NF- 魏 B, including the up-regulation of anti-apoptotic and inflammatory response genes downstream of NF- 魏 B. Inhibition of NF- 魏 B pathway increased apoptosis induced by YopE. In mechanism, we found that YopE can significantly promote the dissociation of p65 and I 魏 B 偽. At the same time, the inducible expression system of YopE / YopEo R144A is constructed, and the experimental results are verified by the system. In addition, the effects of YOPE / YopEr R144A on the biological characteristics of HeLa cells were studied by using inducible expression system. It was found that YopE inhibited the production of ROS induced by Rosup, blocked cell cycle and promoted the expression of p21 protein. In conclusion, we found that YopE may play an important role in the early infection of Yersinia pestis by promoting the activation of NF- 魏 B and enhancing the viability of cells by interacting with p65.
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R378

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本文編號(hào)：1917377