本文選題：腫瘤靶向治療 + VEGF-SLC融合蛋白��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：目的: 為了將肺癌靶向治療和自體免疫增強(qiáng)療法相結(jié)合,本研究擴(kuò)增血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和次級淋巴組織趨化因子(SLC)的融合基因,構(gòu)建VEGF-SLC融合基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pQE30-VEGF-SLC,在E.coli中高效表達(dá)和純化重組VEGF-SLC融合蛋白,并在體外檢測其生物學(xué)活性,為研究和開發(fā)新型靶向腫瘤生物制劑奠定基礎(chǔ)。 方法: 1.以A549細(xì)胞mRNA為模板,RT-PCR擴(kuò)增VEGF基因片段,以pET32a(+)/SLC質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增SLC基因片段,再以Gene SOEing法擴(kuò)增VEGF-SLC融合基因,然后將其插入原核表達(dá)質(zhì)粒pQE30中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE30-VEGF-SLC。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和DNA測序鑒定后,轉(zhuǎn)化E.coli M15,用IPTG誘導(dǎo)目的基因表達(dá)。Western bolt鑒定后,采用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化目的蛋白,然后采取逐步降低尿素濃度的方法使重組蛋白復(fù)性。 2.用不同濃度梯度的重組蛋白及陰性對照包被96孔板,經(jīng)封閉洗滌后分別與A549細(xì)胞和對照MRC-5共培養(yǎng)1h,結(jié)晶紫染色,觀察重組蛋白VEGF-SLC對細(xì)胞的粘附情況,通過細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)評價(jià)重組蛋白的腫瘤靶向性。 3.將不同濃度梯度的重組蛋白及陰性對照加到96孔板中,每組各設(shè)3復(fù)孔,每孔上室加入人外周血淋巴細(xì)胞懸液孵育4h后,顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并計(jì)數(shù),計(jì)算趨化指數(shù),通過趨化實(shí)驗(yàn)檢測重組蛋白對外周血淋巴細(xì)胞的趨化能力。 結(jié)果: 1.經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切及DNA測序證實(shí)pQE30-VEGF-SLC原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功;將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15后、經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),獲得了重組VEGF-SLC融合蛋白(rVEGE-SLC)。融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析,分子量約為28KDa,主要以包涵體形式存在,通過6×His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化后,重組蛋白純度達(dá)90%以上。 2.在細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)中,被rVEGF-SLC融合蛋白包被的孔內(nèi)明顯有A549細(xì)胞粘附。粘附的細(xì)胞數(shù)量隨rVEGF-SLC融合蛋白濃度增加而增多。陰性對照孔和MRC-5對照細(xì)胞孔無明顯細(xì)胞粘附。 3.在趨化實(shí)驗(yàn)中,rVEGF-SLC融合蛋白能引起人外周血淋巴細(xì)胞發(fā)生明顯的遷移,并在3μg/L時(shí)達(dá)到最大趨化指數(shù)。 結(jié)論: 1.成功構(gòu)建pQE30-VEGF-SLC原核表達(dá)質(zhì)粒,且能在大腸桿菌M15中高效表達(dá)重組VEGF-SLC融合蛋白,為探索腫瘤生物治療新途徑奠定了基礎(chǔ)。 2. rVEGF-SLC融合蛋白在體外對人肺腺癌A549細(xì)胞具有明顯的粘附作用,但是對人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5細(xì)胞(非腫瘤對照細(xì)胞)且無明顯粘附效應(yīng),證實(shí)了其腫瘤靶向性;趨化實(shí)驗(yàn)證實(shí),rVEGF-SLC融合蛋白對人外周血淋巴細(xì)胞具有明顯的趨化效應(yīng)。因此,本實(shí)驗(yàn)重組表達(dá)的rVEGF-SLC融合蛋白兼具天然VEGF和SLC各自的生物學(xué)活性。該腫瘤靶向性融合蛋白的制備和研究,為探索肺癌及其它腫瘤的靶向治療和免疫治療綜合途徑奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective: In order to combine lung cancer targeting therapy with autologous immunoenhancement therapy, the fusion genes of vascular endothelial growth factor (VEGF) and secondary lymphoid tissue chemokine (SLC) were amplified. The prokaryotic expression plasmid pQE30-VEGF-SLC of VEGF-SLC fusion gene was constructed. The recombinant VEGF-SLC fusion protein was highly expressed and purified in E.coli. The biological activity of pQE30-VEGF-SLC was detected in vitro, which laid a foundation for the research and development of novel targeted tumor biological agents. Methods: 1. The VEGF gene fragment was amplified by RT-PCR using A549 cell mRNA as template, the SLC gene fragment was amplified by using pET32a plasmid as template, and the VEGF-SLC fusion gene was amplified by Gene SOEing method, then inserted into the prokaryotic expression plasmid pQE30 to construct the recombinant plasmid pQE30-VEGF-SLC. After restriction endonuclease digestion and DNA sequencing, the recombinant plasmid was transformed into E.coli M15 and identified by IPTG induced target gene expression. Western bolt was used to identify the recombinant plasmid. The target protein was purified by Ni-Agarose His tag protein purification kit. Then the recombinant protein was renatured by decreasing urea concentration gradually. 2. The 96 well plate was coated with recombinant protein with different concentration gradient and negative control. After washing, the recombinant protein was co-cultured with A549 cells and control MRC-5 for 1 hour. The adhesion of recombinant protein VEGF-SLC to the cells was observed by crystal violet staining. Tumor targeting of recombinant protein was evaluated by cell adhesion assay. 3. The recombinant protein with different concentration gradient and negative control were added to the 96 well plate. Each group was divided into 3 multiple holes. After incubated with human peripheral blood lymphocyte suspension for 4 hours, the migration of cells was observed and counted under microscope, and the chemotaxis index was calculated. The chemotactic ability of recombinant protein to peripheral blood lymphocytes was detected by chemotaxis experiment. Results: 1. It was confirmed by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing that the prokaryotic expression plasmid of pQE30-VEGF-SLC was successfully constructed, and the recombinant VEGF-SLC fusion protein, rVEGE-SLC, was obtained after being transformed into E. coli M15 and expressed by IPTG. By SDS-PAGE analysis, the molecular weight of the fusion protein was about 28K Daa, which mainly existed in the form of inclusion body. The purity of the recombinant protein was over 90% after purification by 6 脳 His tag protein kit. 2. In the cell adhesion assay, A549 cell adhesion was observed in the pore coated with rVEGF-SLC fusion protein. The number of adherent cells increased with the increase of rVEGF-SLC fusion protein concentration. There was no significant cell adhesion between negative control pore and MRC-5 control. 3. In chemotactic experiments, rVEGF-SLC fusion protein can induce the migration of human peripheral blood lymphocytes and reach the maximum chemotaxis index at 3 渭 g / L. Conclusion: 1. The prokaryotic expression plasmid of pQE30-VEGF-SLC was successfully constructed, and the recombinant VEGF-SLC fusion protein could be expressed efficiently in E. coli M15, which laid a foundation for exploring a new way of tumor biotherapy. 2. RVEGF-SLC fusion protein had obvious adhesion to human lung adenocarcinoma A549 cells in vitro, but had no significant adhesion effect on human embryonic lung fibroblasts MRC-5 cells (non-tumor control cells), which confirmed its tumor targeting; The chemotaxis experiment confirmed that rVEGF-SLC fusion protein had obvious chemotaxis effect on human peripheral blood lymphocytes. Therefore, the recombinant rVEGF-SLC fusion protein has the biological activities of both natural VEGF and SLC. The preparation and study of the tumor targeting fusion protein lay a foundation for exploring the comprehensive approach of targeted therapy and immunotherapy for lung cancer and other tumors.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392-33

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1 記者 朱敏麗　通訊員 潘越;中國醫(yī)藥城首批融合蛋白試劑出口[N];泰州日報(bào);2010年

2 金陵;融合蛋白試劑首次出口美國[N];中國醫(yī)藥報(bào);2010年

3 吳紅梅;我省首批融合蛋白試劑出口美國[N];新華日報(bào);2010年

4 記者 張曄　通訊員 劉寧春;一種有效治療冠心病的融合蛋白發(fā)現(xiàn)[N];科技日報(bào);2009年

5 通訊員 沈季 記者 張兆軍;抗腫瘤融合蛋白進(jìn)入臨床試驗(yàn)[N];科技日報(bào);2005年

6 記者 魏巍 通訊員 沈季;吉大一抗腫瘤新藥進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[N];長春日報(bào);2005年

7 馮衛(wèi)東;抑制蛋白相互作用可成為治癌新方法[N];科技日報(bào);2009年

8 ;吉大抗腫瘤生物工程新藥進(jìn)入臨床試驗(yàn)[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2005年

9 本報(bào)記者　 賴強(qiáng);單抗藥物期待中國加速度[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2006年

10 董丹　劉昱輝 吳元華;基因工程生產(chǎn)降鈣素研究方興未艾[N];中國醫(yī)藥報(bào);2007年

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1 柏亞鐸;犬瘟熱病毒、犬冠狀病毒入侵宿主細(xì)胞機(jī)制研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

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3 王玉梅;嵌合降鈣素基因的構(gòu)建及表達(dá)[D];中國海洋大學(xué);2005年

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5 石炳興;靶向溶栓抗凝雙功能融合蛋白的構(gòu)建表達(dá)及在血栓疾病治療中的應(yīng)用研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

6 蔣驊;GST-EGFR融合蛋白沖擊樹突狀細(xì)胞治療頭頸部鱗狀細(xì)胞癌體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察[D];浙江大學(xué);2008年

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1 蔣攀;腫瘤靶向性VEGF-SLC融合蛋白的原核表達(dá)及活性鑒定[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

2 陳U，

本文編號(hào)：1917282