本文選題：生長(zhǎng)板 + 組織工程��； 參考：《華中科技大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：目的： 1.研究大鼠骺板軟骨細(xì)胞及前軟骨干細(xì)胞(PSCs)接種殼聚糖/藻酸鹽復(fù)合多孔支架體外三維培養(yǎng),探討其構(gòu)建組織工程化骺板的可行性。 2.研究動(dòng)態(tài)壓應(yīng)力對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠骺板軟骨細(xì)胞外基質(zhì)以及甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP) mRNA表達(dá)的影響。 3.研究動(dòng)態(tài)壓應(yīng)力對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠骺板軟骨細(xì)胞Sox9 mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響,并初步探討其力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 4.研究動(dòng)態(tài)張應(yīng)力對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)表達(dá)的影響,并初步探討細(xì)胞骨架是否參與該力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。 方法： 1.冷凍干燥法制備殼聚糖/藻酸鹽復(fù)合三維多孔支架；機(jī)械分離與酶消化相結(jié)合分離骺板軟骨細(xì)胞；免疫磁珠分選前軟骨干細(xì)胞(PSCs),誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞特性方向分化；細(xì)胞接種支架體外三維培養(yǎng),掃描電鏡觀察細(xì)胞粘附、增殖,MTT評(píng)估細(xì)胞增殖狀況,RT-PCR檢測(cè)成軟骨分化指標(biāo),阿辛藍(lán)法測(cè)定細(xì)胞蛋白多糖(GAG)的合成情況。 2.分離并體外培養(yǎng)大鼠骺板軟骨細(xì)胞,用自行設(shè)計(jì)制作的可控細(xì)胞壓力加載裝置對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的壓應(yīng)力刺激,采用RT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)各組軟骨特性細(xì)胞外基質(zhì)(Ⅱ型膠原、X型膠原以及aggrecan)以及PTHrP mRNA表達(dá)并進(jìn)行半定量分析。 3.大鼠骺板軟骨細(xì)胞分組予以動(dòng)態(tài)壓應(yīng)力和鈣離子拮抗劑硝苯地平作用24小時(shí)。實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot檢測(cè)分析各組細(xì)胞的Sox9 mRNA及蛋白表達(dá)情況；細(xì)胞行Fluo-3/AM染色,激光共聚焦顯微鏡(LSCM)觀測(cè)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度。 4.免疫磁珠分選骺板前肥大/肥大層軟骨細(xì)胞,細(xì)胞予以不同強(qiáng)度(3%、6%、12%形變)的動(dòng)態(tài)張應(yīng)力(1Hz)刺激作用24小時(shí),實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞的PTHrP mRNA和蛋白的表達(dá)情況；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化。細(xì)胞予以一定的張應(yīng)力刺激和細(xì)胞骨架松弛素D (2μM), FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽行細(xì)胞骨架微絲(F-actin)染色,激光共聚焦掃描顯微鏡(LSCM)觀測(cè)各組細(xì)胞骨架形態(tài)變化。 結(jié)果： 1.采用冷凍干燥法制備的殼聚糖/藻酸鹽復(fù)合三維多孔支架具有較好的孔徑及孔隙率；PSCs體外培養(yǎng)增殖迅速,誘導(dǎo)后的PSCsⅡ型膠原免疫細(xì)胞染色及甲苯胺蘭、番紅O染色陽(yáng)性；骺板軟骨細(xì)胞和誘導(dǎo)后的PSCs接種支架后生長(zhǎng)良好并分泌細(xì)胞外基質(zhì),Sox9、Ⅱ型膠原均陽(yáng)性表達(dá),培養(yǎng)14天后培養(yǎng)液GAG含量?jī)山M之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2.骺板軟骨細(xì)胞在30 mmHg、60 mmHg、90 mmHg動(dòng)態(tài)壓力培養(yǎng)環(huán)境下生長(zhǎng)良好,各時(shí)間點(diǎn)PTHrP、Ⅱ型膠原以及aggrecan mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組(P0.05)；X型膠原表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3.骺板軟骨細(xì)胞在90mmHg(12kPa)動(dòng)態(tài)壓應(yīng)力下培養(yǎng)24小時(shí)后,實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示單純壓應(yīng)力組其Sox9 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于未受力的對(duì)照組(P0.05)；添加硝苯地平的壓應(yīng)力組其Sox9表達(dá)水平亦高于對(duì)照組(P0.05),但低于單純壓應(yīng)力組(P0.05).LSCM結(jié)果顯示各組胞內(nèi)鈣離子平均熒光強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.動(dòng)態(tài)張應(yīng)力對(duì)骺板前肥大/肥大軟骨細(xì)胞PTHrP表達(dá)的影響呈劑量和時(shí)間依賴性,高強(qiáng)度(12%形變)的張應(yīng)力增加細(xì)胞死亡率。強(qiáng)度為6%形變的動(dòng)態(tài)張應(yīng)力(1Hz)作用24小時(shí)明顯上調(diào)PTHrP表達(dá),LSCM結(jié)果顯示細(xì)胞F-actin在受力后發(fā)生重構(gòu)。細(xì)胞骨架松弛素D能部分阻斷應(yīng)力所致的細(xì)胞PTHrP表達(dá)的上調(diào)。 結(jié)論： 1. PSCs誘導(dǎo)后向軟骨細(xì)胞功能方向分化,與殼聚糖/藻酸鹽三維多孔支架復(fù)合有望用于骺板損傷修復(fù)。 2.適當(dāng)?shù)膭?dòng)態(tài)壓應(yīng)力能有效促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠骺板軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原及aggrecan mRNA表達(dá),PTHrP在此細(xì)胞力學(xué)信號(hào)響應(yīng)過(guò)程中可能起重要作用。 3.適當(dāng)?shù)膭?dòng)態(tài)壓應(yīng)力能促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠骺板軟骨細(xì)胞Sox9 mRNA及蛋白的表達(dá),細(xì)胞鈣離子通道可能參與該力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。 4.動(dòng)態(tài)張應(yīng)力能影響體外培養(yǎng)的大鼠骺板前肥大/肥大軟骨細(xì)胞PTHrP mRNA和蛋白的表達(dá)水平,細(xì)胞骨架參與該力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。
[Abstract]:Objective:
1. the chondrocytes of the epiphyseal plate and the anterior chondrocytes (PSCs) were inoculated with chitosan / alginate composite porous scaffold in vitro, and the feasibility of constructing the tissue engineered epiphyseal plate was investigated.
2. to study the effect of dynamic compressive stress on the extracellular matrix and the expression of parathyroid hormone related protein (PTHrP) mRNA in epiphyseal plate of rats.
3. to study the effect of dynamic compressive stress on the expression of Sox9 mRNA and protein in rat epiphyseal plate chondrocytes in vitro, and to preliminarily explore the mechanism of mechanical signal transduction.
4. the effects of dynamic tensile stress on the expression of parathyroid hormone related protein (PTHrP) in the cultured rat growth plate chondrocytes were investigated, and whether the cytoskeleton was involved in the mechanical signal transduction process was preliminarily investigated.
Method錛，

本文編號(hào)：1917081