本文選題：恥垢分枝桿菌 + L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺銜接雙糖��； 參考：《大連醫(yī)科大學》2012年碩士論文

【摘要】：結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）是結核病的致病菌，全球大約有1/3人口攜帶過這種桿菌。近年來，由于幾種藥物長時間使用，使得結核桿菌出現(xiàn)耐多藥甚至廣泛耐藥特性。因此迫切需要尋找抗結核藥物的新靶點。 恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)和結核分枝桿菌同屬于分枝桿菌屬，而對于結核分枝桿菌細胞壁的研究，通常利用與結核分枝桿菌有相同細胞壁結構，但生長快速且無致病性的恥垢分枝桿菌mc2155菌株作為實驗模型。分枝桿菌細胞壁具有其獨特的結構，它的核心結構由三部分組成的，由外至內依次是分枝菌酸（mycolic acid）、聚阿拉伯半乳糖（arabinogalactan, AG）和肽聚糖（peptidoglycan, PG）。其中聚阿拉伯半乳糖和肽聚糖之間是由L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺（L-rhamnose-D-N-acetyl-glucosamine）銜接雙糖共價連接起來的。 L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺銜接雙糖分子是維持分枝桿菌細胞壁結構穩(wěn)定的重要成分，，也是分枝桿菌生存的必要條件。L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺雙糖銜接分子的合成通過兩步反應實現(xiàn)的：第一步，UDP-N-乙酰葡糖胺（UDP-GlcNAc）在WecA酶（N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉移酶）的作用下，將基團N-乙酰葡糖胺-1-磷酸（GlcNAc-1-P）轉移到受體C50-P （Decaprenyl phosphate）上形成C50-P-P GlcNAc。第二步，產物再作為受體在WbbL酶（鼠李糖基轉移酶)的作用下，接受一個來自于dTDP-鼠李糖（dTDP-Rhamnose）提供的鼠李糖基，最終生成L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺雙糖銜接分子。L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺銜接雙糖分子的合成過程中WecA酶起到重要的催化作用，找到WecA酶的基因有利于我們找到抑制WecA酶合成的方法，從而抑制L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺銜接雙糖分子的合成，最終影響分枝桿菌生長。本實驗室的前期的研究已經發(fā)現(xiàn)MSMEG4947基因為恥垢分枝桿菌的WecA蛋白編碼基因wecA，同時證明了wecA是分枝桿菌生長必需基因。綜上，WecA蛋白很可能是一個抗分枝桿菌尤其是結核分枝桿菌的潛在靶點。 目的： 1．使用PCR方法從恥垢分枝桿菌基因組中擴增出Sm wecA，構建pMD18-Sm wecA克隆載體；2.構建pET29b-Sm wecA表達載體，并在E. coli BL2（1DE3）、CD41（DE3）和ER2566菌株中誘導表達；3.利用高效液相色譜（HPLC）技術對WecA酶活性進行鑒定；4.利用雙向電泳技術，對敲除wecA基因前后，恥垢分枝桿菌中蛋白的變化情況進行比對，來分析與WecA酶相關的蛋白。 結果： 1．使用PCR方法從恥垢分枝桿菌基因組中擴增出Sm wecA，構建pMD18-Sm wecA克隆載體 使用根據Sm wecA（MSMEG4947）基因核苷酸序列設計出的上下游引物，以M. smegmatis mc2155基因組為模板，使用LA Taq DNA聚合酶進行PCR擴增，然后用QIAEXⅡGel Extraction Kit對得到的PCR產物進行回收和純化，電泳鑒定。 將pMD18T克隆質粒與Sm wecA基因片段連接后，構建的pMD18-Sm wecA克隆載體，選取NcoⅠ和BamHIII對pMD18-Sm wecA重組質粒酶切鑒定，選取電泳鑒定正確的pMD18-Sm wecA重組質粒送于寶生物工程大連公司進行核苷酸序列的測定。 2．構建pET29b-Sm wecA表達載體，并在E. coli BL21（DE3）、CD41（DE3）、ER2566菌株中誘導表達 使用NdeⅠ和XhoⅠ的雙酶切體系分別對pMD18-Sm wecA質粒和pET29b載體進行酶切，將Sm wecA基因片段和酶切后的線形pET29b載體片段連接，構建了pET29b-Sm wecA表達載體。 用pET29b-Sm wecA表達載體轉化E. coli BL21(DE3)、CD41（DE3）和ER2566菌株，在37℃下用終濃度1mM的IPTG誘導將上清、沉淀和總蛋白進行Dot blot，SDS-PAGE和Western blot分析。 在25℃條件下用終濃度1mM的IPTG誘導pET29b-Sm wecA/ER2566生長16h。超聲破碎細胞后，把離心后的上清液再超速離心制備膜組分，然后用去污劑DDM（n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）處理，得到蛋白樣品后進行Western blot分析。 3．利用高效液相色譜（HPLC）技術對WecA酶活性進行鑒定 使用鎳層析柱純化WecA蛋白。 建立反應體系，在反應底物UDP-GlcNAc和C50-P混合液中加入純化的WecA蛋白共同孵育30min后，使用氯仿/甲醇/氨水萃取反應產物，使用含反應產物的水相進行HPLC檢測，通過檢測底物之一UDP-GlcNAc峰面積的減少量的方法來檢測WecA酶的活性。 4．利用雙向電泳技術，對敲除wecA基因前后，恥垢分枝桿菌中蛋白的變化情況進行比對，來分析與WecA酶相關的蛋白。 小體積培養(yǎng)恥垢分枝桿菌mc2155YJ-2菌株進行溫度轉換試驗，描繪出生長曲線以確定提取蛋白時間，然后大體積培養(yǎng)恥垢分枝桿菌mc2155YJ-2菌株溫度轉換后，在相應時間段收集細菌，提取總蛋白。以未經過溫度轉化的恥垢分枝桿菌mc2155YJ-2菌的總蛋白作對照。 對兩種總蛋白樣品分別進行水化，等電聚焦電泳，平衡，SDS-PAGE電泳。電泳結束后，使用銀染試劑盒對兩塊凝膠進行染色。對兩塊凝膠進行比對，尋找差異點。 結論： 1．從恥垢分枝桿菌基因組中獲取Sm wecA基因，構建了pET29b-Sm wecA表達載體，并在ER2566中得到表達。 2．純化了表達出來的恥垢分枝桿菌WecA酶，通過HPLC的方法檢測了酶的活性，進一步驗證了MSMEG4947基因為恥垢分枝桿菌的WecA蛋白編碼基因wecA。為揭示恥垢分枝桿菌的WecA酶催化特性奠定了基礎。作為結核分枝桿菌WecA酶活性研究的重要補充，反映出分枝桿菌中WecA酶具有GlcNAc-1-P轉移酶活性特點。 3．利用雙向電泳技術對wecA敲除前后恥垢分枝桿菌mc2155菌體內總蛋白變化情況進行了初步的比對分析。為后續(xù)對WecA酶相關蛋白的分析探尋了一條道路。
[Abstract]:Mycobacterium tuberculosis is a pathogen of tuberculosis , about 1 / 3 of the world ' s population carries the bacillus . In recent years , due to the long - term use of several drugs , the mycobacterium tuberculosis has multiple drug - resistant and even broad - resistant characteristics . Therefore , it is urgent to find new targets for anti - tuberculosis drugs .

Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis belong to the genus Mycobacterium , and for the study of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis , it is common to use Mycobacterium tuberculosis mc2155 strain with the same cell wall structure as Mycobacterium tuberculosis as the experimental model . The cell wall of Mycobacterium tuberculosis has its unique structure , and its core structure consists of three parts , which are mycolic acid , poly - Arabinose ( AG ) and peptidoglycan ( PG ) . wherein the poly - arabonic galactose and the peptidoglycan are covalently linked by L - rhamnoside - D - N - acetyl - glucosamine - linked disaccharide .

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本文編號：1913460