本文選題：恥垢分枝桿菌 + L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺銜接雙糖��； 參考：《大連醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）是結(jié)核病的致病菌，全球大約有1/3人口攜帶過這種桿菌。近年來，由于幾種藥物長時間使用，使得結(jié)核桿菌出現(xiàn)耐多藥甚至廣泛耐藥特性。因此迫切需要尋找抗結(jié)核藥物的新靶點(diǎn)。 恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)和結(jié)核分枝桿菌同屬于分枝桿菌屬，而對于結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的研究，通常利用與結(jié)核分枝桿菌有相同細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，但生長快速且無致病性的恥垢分枝桿菌mc2155菌株作為實驗?zāi)Ｐ�。分枝桿菌細(xì)胞壁具有其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，它的核心結(jié)構(gòu)由三部分組成的，由外至內(nèi)依次是分枝菌酸（mycolic acid）、聚阿拉伯半乳糖（arabinogalactan, AG）和肽聚糖（peptidoglycan, PG）。其中聚阿拉伯半乳糖和肽聚糖之間是由L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺（L-rhamnose-D-N-acetyl-glucosamine）銜接雙糖共價連接起來的。 L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺銜接雙糖分子是維持分枝桿菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要成分，，也是分枝桿菌生存的必要條件。L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺雙糖銜接分子的合成通過兩步反應(yīng)實現(xiàn)的：第一步，UDP-N-乙酰葡糖胺（UDP-GlcNAc）在WecA酶（N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶）的作用下，將基團(tuán)N-乙酰葡糖胺-1-磷酸（GlcNAc-1-P）轉(zhuǎn)移到受體C50-P （Decaprenyl phosphate）上形成C50-P-P GlcNAc。第二步，產(chǎn)物再作為受體在WbbL酶（鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶)的作用下，接受一個來自于dTDP-鼠李糖（dTDP-Rhamnose）提供的鼠李糖基，最終生成L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺雙糖銜接分子。L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺銜接雙糖分子的合成過程中WecA酶起到重要的催化作用，找到WecA酶的基因有利于我們找到抑制WecA酶合成的方法，從而抑制L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺銜接雙糖分子的合成，最終影響分枝桿菌生長。本實驗室的前期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MSMEG4947基因為恥垢分枝桿菌的WecA蛋白編碼基因wecA，同時證明了wecA是分枝桿菌生長必需基因。綜上，WecA蛋白很可能是一個抗分枝桿菌尤其是結(jié)核分枝桿菌的潛在靶點(diǎn)。 目的： 1．使用PCR方法從恥垢分枝桿菌基因組中擴(kuò)增出Sm wecA，構(gòu)建pMD18-Sm wecA克隆載體；2.構(gòu)建pET29b-Sm wecA表達(dá)載體，并在E. coli BL2（1DE3）、CD41（DE3）和ER2566菌株中誘導(dǎo)表達(dá)；3.利用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)對WecA酶活性進(jìn)行鑒定；4.利用雙向電泳技術(shù)，對敲除wecA基因前后，恥垢分枝桿菌中蛋白的變化情況進(jìn)行比對，來分析與WecA酶相關(guān)的蛋白。 結(jié)果： 1．使用PCR方法從恥垢分枝桿菌基因組中擴(kuò)增出Sm wecA，構(gòu)建pMD18-Sm wecA克隆載體 使用根據(jù)Sm wecA（MSMEG4947）基因核苷酸序列設(shè)計出的上下游引物，以M. smegmatis mc2155基因組為模板，使用LA Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用QIAEXⅡGel Extraction Kit對得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化，電泳鑒定。 將pMD18T克隆質(zhì)粒與Sm wecA基因片段連接后，構(gòu)建的pMD18-Sm wecA克隆載體，選取NcoⅠ和BamHIII對pMD18-Sm wecA重組質(zhì)粒酶切鑒定，選取電泳鑒定正確的pMD18-Sm wecA重組質(zhì)粒送于寶生物工程大連公司進(jìn)行核苷酸序列的測定。 2．構(gòu)建pET29b-Sm wecA表達(dá)載體，并在E. coli BL21（DE3）、CD41（DE3）、ER2566菌株中誘導(dǎo)表達(dá) 使用NdeⅠ和XhoⅠ的雙酶切體系分別對pMD18-Sm wecA質(zhì)粒和pET29b載體進(jìn)行酶切，將Sm wecA基因片段和酶切后的線形pET29b載體片段連接，構(gòu)建了pET29b-Sm wecA表達(dá)載體。 用pET29b-Sm wecA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)、CD41（DE3）和ER2566菌株，在37℃下用終濃度1mM的IPTG誘導(dǎo)將上清、沉淀和總蛋白進(jìn)行Dot blot，SDS-PAGE和Western blot分析。 在25℃條件下用終濃度1mM的IPTG誘導(dǎo)pET29b-Sm wecA/ER2566生長16h。超聲破碎細(xì)胞后，把離心后的上清液再超速離心制備膜組分，然后用去污劑DDM（n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）處理，得到蛋白樣品后進(jìn)行Western blot分析。 3．利用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)對WecA酶活性進(jìn)行鑒定 使用鎳層析柱純化WecA蛋白。 建立反應(yīng)體系，在反應(yīng)底物UDP-GlcNAc和C50-P混合液中加入純化的WecA蛋白共同孵育30min后，使用氯仿/甲醇/氨水萃取反應(yīng)產(chǎn)物，使用含反應(yīng)產(chǎn)物的水相進(jìn)行HPLC檢測，通過檢測底物之一UDP-GlcNAc峰面積的減少量的方法來檢測WecA酶的活性。 4．利用雙向電泳技術(shù)，對敲除wecA基因前后，恥垢分枝桿菌中蛋白的變化情況進(jìn)行比對，來分析與WecA酶相關(guān)的蛋白。 小體積培養(yǎng)恥垢分枝桿菌mc2155YJ-2菌株進(jìn)行溫度轉(zhuǎn)換試驗，描繪出生長曲線以確定提取蛋白時間，然后大體積培養(yǎng)恥垢分枝桿菌mc2155YJ-2菌株溫度轉(zhuǎn)換后，在相應(yīng)時間段收集細(xì)菌，提取總蛋白。以未經(jīng)過溫度轉(zhuǎn)化的恥垢分枝桿菌mc2155YJ-2菌的總蛋白作對照。 對兩種總蛋白樣品分別進(jìn)行水化，等電聚焦電泳，平衡，SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，使用銀染試劑盒對兩塊凝膠進(jìn)行染色。對兩塊凝膠進(jìn)行比對，尋找差異點(diǎn)。 結(jié)論： 1．從恥垢分枝桿菌基因組中獲取Sm wecA基因，構(gòu)建了pET29b-Sm wecA表達(dá)載體，并在ER2566中得到表達(dá)。 2．純化了表達(dá)出來的恥垢分枝桿菌WecA酶，通過HPLC的方法檢測了酶的活性，進(jìn)一步驗證了MSMEG4947基因為恥垢分枝桿菌的WecA蛋白編碼基因wecA。為揭示恥垢分枝桿菌的WecA酶催化特性奠定了基礎(chǔ)。作為結(jié)核分枝桿菌WecA酶活性研究的重要補(bǔ)充，反映出分枝桿菌中WecA酶具有GlcNAc-1-P轉(zhuǎn)移酶活性特點(diǎn)。 3．利用雙向電泳技術(shù)對wecA敲除前后恥垢分枝桿菌mc2155菌體內(nèi)總蛋白變化情況進(jìn)行了初步的比對分析。為后續(xù)對WecA酶相關(guān)蛋白的分析探尋了一條道路。
[Abstract]:Mycobacterium tuberculosis is a pathogen of tuberculosis , about 1 / 3 of the world ' s population carries the bacillus . In recent years , due to the long - term use of several drugs , the mycobacterium tuberculosis has multiple drug - resistant and even broad - resistant characteristics . Therefore , it is urgent to find new targets for anti - tuberculosis drugs .

Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis belong to the genus Mycobacterium , and for the study of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis , it is common to use Mycobacterium tuberculosis mc2155 strain with the same cell wall structure as Mycobacterium tuberculosis as the experimental model . The cell wall of Mycobacterium tuberculosis has its unique structure , and its core structure consists of three parts , which are mycolic acid , poly - Arabinose ( AG ) and peptidoglycan ( PG ) . wherein the poly - arabonic galactose and the peptidoglycan are covalently linked by L - rhamnoside - D - N - acetyl - glucosamine - linked disaccharide .

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本文編號：1913460