本文選題：DNA損傷反應(DDR) + Nbs1��； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2012年博士論文

【摘要】：Nijmegen breakage syndrome (NBS)是一種人類染色體不穩(wěn)定性綜合征,具有頭小畸形(microcephaly)的突出臨床表現(xiàn),是由NBS1基因的次形態(tài)突變所引起。NBS1(小鼠稱Nbn)基因的編碼產物Nbsl是DNA損傷反應(DNA damage response,DDR)的一個關鍵蛋白分子。Nbsl與另外兩個蛋白Mre11和Rad50共同組成Mrell-Rad50-Nbsl (MRN)復合體,該復合體在DNA損傷反應、DNA雙鏈斷裂修復、細胞周期檢驗點激活和維持基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要的作用。增殖活躍和代謝旺盛的細胞常常容易因為復制叉阻滯和代謝產生的活性氧導致大量內源性的DNA損傷。為了維持基因組的穩(wěn)定性和完整性,細胞必須激活一系列復雜而有序的DNA損傷修復機制來修復損傷的DNA。Nbs1或MRN復合體在早期階段就能感應存在于基因組上的損傷并通過激活ATM-Chk2-和ATR-Chk1-p53信號途徑來調控細胞周期檢驗點以阻滯細胞周期的進程,為修復受損的DNA贏得足夠的時間。p53的活化能有效地激活程序性細胞死亡來及時地清除掉不能被修復的受損細胞,避免細胞發(fā)生惡性轉化而形成腫瘤。 為了探討人類NBS腦發(fā)育缺陷的病理機制,我們首先利用Cre-Loxp的技術在小鼠的中樞神經系統(tǒng)特異性敲除Nbn基因(稱NbnCNS-del小鼠)后,獲得了類似于NBS病人具有的microcephaly的表型。NhnCNS-del小鼠表現(xiàn)為生長遲緩,在早期就出現(xiàn)小腦發(fā)育不全、共濟失調、白內障、視神經結構的破壞和變性、白質發(fā)育障礙和膠質細胞的功能紊亂。盡管如此,這些研究仍然沒有從根本上揭示microcephaly發(fā)生的具體分子病理機制。因此,本研究旨在應用NbnCNS-del小鼠模型深入探討Nbs1在大腦發(fā)育中的作用和導致microcephaly的分子機理。 我們的研究發(fā)現(xiàn)：NbnCNS-del小鼠大腦皮質的大小比正常小鼠要小,胼胝體也相對地變薄,模擬了人microcephaly的表現(xiàn)。NbnCNS-del小鼠大腦皮質的Ⅱ/Ⅲ層(外顆粒層／外錐體細胞層)中的細胞數(shù)目明顯地減少,并且Ⅳ和V層(內顆粒層／內錐體細胞層)中的顆粒細胞和大錐體細胞數(shù)也顯著地減少,因而導致了細胞密度的降低和大腦皮質板層結構的變薄。γH2AX的免疫組化染色結果表明在胚腦新皮質快速發(fā)育的過程中Nbs1的缺失導致了大量內源性DNA損傷的聚集。Western blotting的結果顯示Nbs1的缺失影響了ATR-Chk1途徑的活化,Chkl-S345的磷酸化受到明顯的抑制。神經前體細胞的免疫熒光實驗證實了Nbs1的缺失影響了DDR分子如Chk1、BRCAl、Mrell和Mcph1在DNA損傷位點上的募集和foci的形成。Nbs1還具有維持Mcph1蛋白穩(wěn)定性的作用。Nbs1缺失的大腦皮質神經元細胞仍然保留了ATM-Chk2途徑對DNA損傷反應的能力,因而ATM-Chk2途徑的活化激活了由p53介導的Hzf蛋白持續(xù)性且特異性地高表達在Nbsl突變的大腦皮質區(qū)。Hzf與p53結合后,特異性地調控p53對下游靶基因的反式激活作用,促進了p53下游靶分子p21的表達,同時抑制了Bax、Noxa和Puma的轉錄激活,導致了發(fā)育期大腦皮質神經元細胞的增殖減弱和凋亡抑制,最終NbnCNS-del小鼠形成了microcephaly。Trp53的失活突變能夠基本上恢復Nbs1缺陷小鼠的microcephaly表型。 綜上所述,我們的研究揭示了發(fā)育期不同部位的神經元在應答內源性DNA損傷時激活的凋亡反應具有組織空間的特異性,p53的雙重作用導致了Nbs1缺失的大腦皮質和小腦對凋亡的差異性反應。本研究證明了Nbs1在神經發(fā)生中起到的重要作用。
[Abstract]:Nijmegen breakage syndrome (NBS) is a human chromosome instability syndrome with a protruding clinical manifestation of the head small deformity (microcephaly). It is a key protein molecule of the.NBS1 (mouse called Nbn) gene, caused by the secondary mutation of the NBS1 gene, which is a key protein molecule of the DNA damage reaction (DNA damage). The other two proteins, Mre11 and Rad50, together constitute the Mrell-Rad50-Nbsl (MRN) complex, which plays an important role in the DNA damage response, the repair of the double strand breaks of DNA, the activation of cell cycle checkpoints and the maintenance of genomic stability. In order to maintain genomic stability and integrity, to maintain genomic stability and integrity, cells must activate a series of complex and orderly DNA damage repair mechanisms to repair damaged DNA.Nbs1 or MRN complexes that can induce damage to the genome at the early stage and activate ATM-Chk2- and ATR-Chk1-p53 letters in order to maintain genomic stability and integrity. The cell cycle test point is regulated to block the process of cell cycle, and the activation energy of.P53 to repair damaged DNA can effectively activate programmed cell death to remove the damaged cells that can not be repaired in time, and avoid the malignant transformation of cells to form tumors.
In order to explore the pathological mechanism of human NBS brain development defects, we first use Cre-Loxp technique in the specific knockout of the Nbn gene in the central nervous system of mice (called NbnCNS-del mice), and the phenotype of.NhnCNS-del mice with microcephaly similar to those of NBS patients is growth retardation, and cerebellar dysplasia appears in the early stage. Ataxia, cataract, optic nerve structure damage and degeneration, white matter development disorder and glial cell dysfunction are still not fundamentally revealed in these studies. Therefore, the purpose of this study is to explore the application of NbnCNS-del mouse model to the development of Nbs1 in the development of the brain. Use and cause the molecular mechanism of microcephaly.
Our study found that the size of the cerebral cortex in NbnCNS-del mice was smaller than that in normal mice, and the corpus callosum was also relatively thinner, which simulated the human microcephaly expression in the.NbnCNS-del mice of the brain cortex of the second / third layer (outer granular layer / outer pyramidal cell layer), and the number of cells in the IV and V layers (inner granular layer / inner cone thin). The number of granular cells and large pyramidal cells in the cell layer also decreased significantly, resulting in the decrease of cell density and the thinning of the lamellar structure of the cerebral cortex. The results of immunohistochemical staining of gamma H2AX showed that the deletion of Nbs1 resulted in the aggregation of a large number of endogenous DNA injuries aggregated.Western blotting during the rapid development of the neocortex of the embryonic brain. The results show that the deletion of Nbs1 affects the activation of the ATR-Chk1 pathway and the phosphorylation of Chkl-S345 is obviously inhibited. The immunofluorescence test of the neural precursor cells confirms that the deletion of Nbs1 affects the DDR molecules such as Chk1, BRCAl, Mrell and Mcph1 are raised on DNA damage sites and foci form.Nbs1 also has the effect of maintaining the stability of the protein. The.Nbs1 deficient cerebral cortical neurons still retain the ability of the ATM-Chk2 pathway to respond to DNA damage, so the activation of the ATM-Chk2 pathway activates the p53 mediated Hzf protein persistently and specifically highly expressed in the Nbsl mutation of the cerebral cortex.Hzf and p53, specifically regulating the trans activation of the p53 to the downstream target gene. It promotes the expression of p21 in the downstream target molecule of p53, and inhibits the transcription activation of Bax, Noxa and Puma, which leads to the decrease of proliferation and inhibition of apoptosis in the cerebral cortical neurons of the developmental stage. Finally, the NbnCNS-del mice have formed the microcephaly.Trp53 inactivation mutation to basically restore the microcephaly phenotype of Nbs1 deficient mice.
To sum up, our study revealed that the apoptotic response activated by neurons in different parts of the developmental phase in response to endogenous DNA damage has the specificity of tissue space. The dual action of p53 leads to the difference in the apoptosis of the cerebral cortex and cerebellum missing from Nbs1. This study proved that Nbs1 plays an important role in neurogenesis. Use.
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363

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本文編號：1913269