本文選題：癲癇 + 神經(jīng)元��； 參考：《吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)》2017年01期

【摘要】：目的:探討匹魯卡品所致小鼠癲癇神經(jīng)元中細(xì)胞骨架絲狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)、調(diào)寧蛋白3(Calponin 3)和Rho相關(guān)含卷曲螺旋蛋白激酶2(ROCK2)的表達(dá),研究癲癇發(fā)作后RhoA/ROCK2通路與Calponin 3和F-actin解聚和重構(gòu)之間的關(guān)系。方法:采用木瓜蛋白酶消化法分離ICR新生小鼠乳鼠皮層神經(jīng)元,生長(zhǎng)至第7天時(shí)用微管關(guān)聯(lián)蛋白2(MAP2)抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色鑒定神經(jīng)元。將培養(yǎng)7d的神經(jīng)元分為對(duì)照組和癲癇模型組,對(duì)照組用神經(jīng)元培養(yǎng)基培養(yǎng),癲癇模型組在神經(jīng)元培養(yǎng)基中分別加入終濃度為2、3和4mmol·L~(-1)匹魯卡品,24h后換為正常培養(yǎng)基。分別在造模后不同時(shí)間點(diǎn)取出各組細(xì)胞固定,進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和熒光染色。采用Alex-546標(biāo)記的phalloidin進(jìn)行熒光染色觀察神經(jīng)元中F-actin分布;免疫組織化學(xué)染色觀察神經(jīng)元中Calponin 3、ROCK2和磷酸化ROCK2(p-ROCK2)表達(dá)和分布。結(jié)果:光鏡下觀察和F-acitn熒光染色,與對(duì)照組比較,造模24h后,2mmol·L~(-1)匹魯卡品組細(xì)胞無(wú)明顯變化;3mmol·L~(-1)匹魯卡品組神經(jīng)元中F-acitn出現(xiàn)解構(gòu),神經(jīng)元部分突起消失,但在更換正常培養(yǎng)基后,細(xì)胞形態(tài)和F-actin結(jié)構(gòu)在造模7d后逐漸恢復(fù);4mmol·L~(-1)匹魯卡品組神經(jīng)元中F-actin結(jié)構(gòu)崩解破壞嚴(yán)重,神經(jīng)元突起不可逆性消失。免疫組織化學(xué)染色,對(duì)照組Calponin 3和ROCK2彌散分布于胞質(zhì)中;在造模1d時(shí)癲癇模型組(3mmol·L~(-1)匹魯卡品)神經(jīng)細(xì)胞中Calponin 3和ROCK2明顯聚集在細(xì)胞膜下方,隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)量明顯上調(diào),位于細(xì)胞膜下方的p-ROCK2表達(dá)量也較對(duì)照組明顯增加,同樣隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)量逐漸升高。結(jié)論:利用3mmol·L~(-1)匹魯卡品成功建立癲癇神經(jīng)元模型。3mmol·L~(-1)匹魯卡品可使神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROCK2活化為p-ROCK2,并上調(diào)神經(jīng)元內(nèi)的ROCK2和p-ROCK2表達(dá)量,促使F-actin解聚導(dǎo)致神經(jīng)元突起部分消失,p-ROCK2激活Calponin 3磷酸化,促進(jìn)F-actin重構(gòu)和神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的恢復(fù)。
[Abstract]:Objective: to investigate the expression of cytoskeletal filamentous actin F-actinine (3(Calponin _ 3) and Rho associated spiroprotein kinase _ 2 (ROCK2) in mouse epileptic neurons induced by pilocarpine. To study the relationship between RhoA/ROCK2 pathway and Calponin 3 and F-actin depolymerization and remodeling after seizure. Methods: the cortical neurons of newborn ICR mice were isolated by papain digestion. The neurons were identified by immunohistochemical staining with microtubule-associated protein 2MAP2) antibody at the 7th day of growth. The neurons cultured for 7 days were divided into control group and epileptic model group. The control group was cultured on neuron medium. In the epileptic model group, the final concentration of 2t3 and 4mmol Lnka-1 were added to the neuron culture medium for 24 hours and then replaced into the normal medium. The cells were fixed at different time points and stained by immunohistochemistry and fluorescence staining. Alex-546 labeled phalloidin was used to observe the distribution of F-actin in neurons, and immunohistochemical staining was used to observe the expression and distribution of Calponin _ 3 rock _ 2 and phosphorylated rock _ 2o _ (p-ROCK2) in neurons. Results: under light microscope and F-acitn fluorescence staining, compared with the control group, there was no obvious change of F-acitn in the neurons of the 2 mmol / L ~ (-1) pilocarpine group after 24 hours of model making, and the neurite disappeared in the neurons of the pilocarpine group, but after replacing the normal culture medium, there was no significant change in the number of F-acitn in the neurons, but after the replacement of the normal culture medium, there was no significant change in the cells in the model group. Cell morphology and F-actin structure gradually recovered after 7 days of modeling. In Pilucapine group, the F-actin structure collapsed seriously, and the neurite irreversibly disappeared. Immunohistochemical staining showed that Calponin _ 3 and ROCK2 were diffused in cytoplasm in control group, and Calponin _ 3 and ROCK2 in epileptic model group (n = 3 mmol L ~ (-1) ~ (-1) pilocarpine on day 1, respectively. The expression of Calponin _ 3 and ROCK2 were significantly increased with the prolongation of culture time, and the expression of Calponin _ 3 and ROCK2 were significantly increased with the prolongation of culture time. The expression of p-ROCK2 under the cell membrane was also significantly higher than that in the control group, and the expression level increased gradually with the extension of culture time. Conclusion: the model of epileptic neuron. 3 mmol / L ~ (-1) Pilucapine can activate ROCK2 into p-ROCK2, and up-regulate the expression of ROCK2 and p-ROCK2 in neurons. F-actin depolymerization induced partial disappearance of neuronal processes and p-ROCK2 activation of Calponin _ 3 phosphorylation, F-actin remodeling and neuronal morphological recovery.
【作者單位】： 吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系;吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科;吉林大學(xué)第一醫(yī)院兒科;
【基金】：吉林省科技廳自然科學(xué)基金資助課題(20130101138JC) 吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)科研支持計(jì)劃青年科研基金資助課題(2069)
【分類號(hào)】：R742.1;R-332

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本文編號(hào)：1857817