本文選題：弓形蟲 + BSR4��； 參考：《蚌埠醫(yī)學(xué)院》2011年碩士論文

【摘要】：目的從弓形蟲Prugniaud（PRU）株總DNA中克隆BSR4基因片段，構(gòu)建pET28a(+)-BSR4重組表達(dá)質(zhì)粒；對(duì)比不同蟲株之間BSR4基因序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析；在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)BSR4，純化表達(dá)產(chǎn)物并檢測(cè)其免疫反應(yīng)性，為弓形蟲病的免疫診斷和疫苗研制以及致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。 方法用本實(shí)驗(yàn)室保種的弓形蟲PRU株腹腔接種昆明鼠，取腦組織勻漿，用小鼠淋巴細(xì)胞分離液純化弓形蟲包囊，提取弓形蟲PRU株的基因組DNA，根據(jù)GenBank中已知弓形蟲ME49株BSR4基因序列設(shè)計(jì)合成引物，在引物中引入NcoI和HindⅢ酶切位點(diǎn)。應(yīng)用PCR技術(shù)從弓形蟲PRU株基因組DNA中擴(kuò)增BSR4基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和HindⅢ切下目的片段，以相同的酶切位點(diǎn)通過T4連接酶亞克隆入pET28a(+)載體中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-BSR4，采用雙酶切及測(cè)序方法鑒定重組質(zhì)粒。采用生物信息學(xué)方法對(duì)BSR4蛋白的理化性質(zhì)、同源性分析以及二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。將重組質(zhì)粒pET28a(+)-BSR4轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中，挑取單個(gè)菌落，培養(yǎng)擴(kuò)增至OD600約為0.5，加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破壁后，分離上清和沉淀，SDS-PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物，對(duì)沉淀中的包涵體經(jīng)8M尿素溶解，，His Trap Ni親和層析柱純化重組蛋白，Western-Blottting鑒定重組BSR4蛋白的免疫反應(yīng)性。改良Bradford(考馬斯亮藍(lán))法測(cè)定純化蛋白濃度。用小鼠淋巴細(xì)胞分離液分離感染及未感染弓形蟲小鼠脾細(xì)胞，以純化抗原刺激小鼠脾細(xì)胞的生長(zhǎng)，48h后加入3H-TdR，繼續(xù)培養(yǎng)24h，檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞淋巴細(xì)胞增殖水平。 結(jié)果PCR體外擴(kuò)增得到目的基因片段長(zhǎng)約1194bp，測(cè)序結(jié)果表明，獲得弓形蟲BSR4基因片段。經(jīng)BLAST同源性對(duì)比顯示，弓形蟲PRU株和ME49株基因序列同源性為100%，是高度保守的序列。雙酶切及測(cè)序結(jié)果顯示目的基因己被正確地連接入重組質(zhì)粒pET28a(+)中。生物信息學(xué)分析表明，BSR4蛋白相對(duì)分子量為42344.75，有2個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，氨基酸序列的前40位為信號(hào)肽序列，N端為信號(hào)肽，C端為疏水序列，預(yù)測(cè)它為糖基磷脂酰肌醇固著蛋白,存在18個(gè)潛在抗原表位及2個(gè)保守功能區(qū)域。重組質(zhì)粒pET28a(+)-BSR4經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在大腸埃希菌BL21(DE3)中表達(dá)，超聲破菌后SDS-PAGE電泳分析取上清和沉淀，結(jié)果表明重組蛋白在37℃時(shí)大量表達(dá)，以包涵體的形式存在。表達(dá)蛋白經(jīng)尿素溶解，His Trap Ni親和層析柱純化，得到可溶性蛋白。Western-blotting檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)一特異性蛋白區(qū)帶，分子量約為45kDa，該條帶能被弓形蟲慢性感染血清識(shí)別。淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，感染弓形蟲小鼠刺激指數(shù)（SI）明顯高于未感染組。 結(jié)論從弓形蟲PRU株中克隆出緩殖子期特異性抗原BSR4基因編碼序列；成功構(gòu)建了目的基因BSR4的重組質(zhì)粒pET28a(+)-BSR4，在大腸埃希菌BL21中以包涵體形式高效表達(dá)了BSR4目的基因片段；該產(chǎn)物具有特異的免疫反應(yīng)性，在體外可刺激記憶性淋巴細(xì)胞明顯增殖。推測(cè)BSR4可能是具有良好應(yīng)用前景的弓形蟲候選疫苗分子，還有望應(yīng)用于弓形蟲慢性感染的檢測(cè)。
[Abstract]:Objective To clone BSR4 gene fragment from the total DNA of Toxoplasma gondii ( PRU ) strain and construct pET28a ( + ) - BSR4 recombinant expression plasmid ;
Bioinformatic analysis was carried out against the sequence of BSR4 gene between different insect strains .
BSR4 was expressed in the prokaryotic expression system , the expression product was purified and its immunoreactivity was detected , which laid the foundation for the study of the immunological diagnosis and vaccine development and the pathogenesis of toxoplasmosis .

Methods The recombinant plasmid pET28a ( + ) - BSR4 was isolated from the genomic DNA of Toxoplasma gondii by PCR . The recombinant plasmid pET28a ( + ) - BSR4 was isolated from the genomic DNA of Toxoplasma gondii . The recombinant plasmid pET28a ( + ) - BSR4 was isolated and purified . The recombinant plasmid pET28a ( + ) - BSR4 was isolated by PCR .

coli BL21 ( DE3 ) . The recombinant plasmid pET28a ( + ) - BSR4 was purified by IPTG to obtain soluble protein . The recombinant plasmid pET28a ( + ) - BSR4 was purified by IPTG to obtain soluble protein . The recombinant plasmid pET28a ( + ) - BSR4 was purified by IPTG to obtain soluble protein .

Conclusion BSR4 gene coding sequence is cloned from the PRU strain of Toxoplasma gondii .
The recombinant plasmid pET28a ( + ) - BSR4 of the target gene BSR4 was successfully constructed , and the gene fragment of BSR4 was expressed in the form of inclusion bodies in E . coli BL21 .
The product has specific immunoreactivity and can stimulate memory lymphocyte proliferation in vitro . It is speculated that BSR4 may be a candidate for toxoplasmosis with good application prospect . It is also expected to be applied to the detection of chronic infection of Toxoplasma gondii .

【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1857439