本文選題：淋巴特異蛋白酪氨酸磷酸酶 + T細胞信號途徑�。� 參考：《山東大學》2012年碩士論文

【摘要】：Lyp (Lymphoid-specific tyrosine phosphatase)是由PTPN22編碼的非受體型酪氨酸磷酸酶,主要在免疫系統(tǒng)中表達。Lyp由807個氨基酸構(gòu)成,包括N端300個氨基酸的催化結(jié)構(gòu)域和C端500個氨基酸左右的調(diào)節(jié)區(qū)域構(gòu)成。當前的研究認為,Lyp可以通過去磷酸化Lck、Fyn、ZAP70等蛋白來負調(diào)控T細胞的信號轉(zhuǎn)導。Lyp的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)C1858T使PTPN22在620位的酪氨酸替換為精氨酸(即R620W突變),攜帶R620W突變的人群更容易患自身免疫性疾病,包括Ⅰ型糖尿病(Type Ⅰ Diabetes, T1D)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)、風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(juvenile idiopathic arthritis, JIA)(?)Grave's disease等。雖然R620W一直被認為是功能增進型的突變,但是最近研究顯示R620W導致自身免疫病可能由于它在T細胞信號轉(zhuǎn)導過程中的功能缺失。同時有研究表明Lyp催化區(qū)域的基因多態(tài)性R263Q可以降低SLE、RA和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)勺患病率,但增加肺結(jié)(pulmonary tuberculosis,PT)的易感性。遺傳學研究還發(fā)現(xiàn)在人類中存在其他Lyp的基因多態(tài)性,包括S20lF,R266W等,其中S201F和R266W不增加Ⅰ型糖尿病的患病風險。為進一步分析這些基因多態(tài)性對Lyp生化性質(zhì)和功能的影響,我們檢測了Lyp基因多態(tài)性S201F、R263Q和R266W對小分子底物,磷酸多肽底物和蛋白底物的磷酸酶活力；以及這些突變導致Lyp在T細胞信號轉(zhuǎn)導途徑和免疫應答中功能的變化。本實驗結(jié)果說明Lyp的S201F突變雖然改變了Lyp對小分子底物的催化活力,但其對磷酸多肽底物和蛋白底物的活力影響甚小,并對Lyp在T細胞中的功能產(chǎn)生較小的影響。Lyp的R263Q和R266W突變顯著減低了其對磷酸多肽底物的活力,并減弱了Lyp對T細胞免疫應答的抑制作用。這些結(jié)果預示除R263Q可減低一些自身免疫性疾病的風險外,R266W基因多態(tài)性也可能通過影響Lyp的功能而對自身免疫性疾病易感性產(chǎn)生影響。 [研究目的] 研究淋巴組織特異酪氨酸磷酸酶(Lyp)的不同突變(S201F、R263Q和R266W的生化特性和細胞功能。 [研究方法] 1.生化特性 (1)用PrimerX軟件設計引物,以PET-16b-Lyp-CD-His-wild type為模板用QuikChange的方法構(gòu)建不同突變的Lyp的質(zhì)粒：3201F, R263Q, R266W。 (2)在BL21大腸桿菌中過表達Lyp催化區(qū)域的蛋白(wild type, S201F, R263Q,R266W),通過Ni2+-NTA柱和CM陽離子交換柱純化,以獲得可以進行生化分析的高純度蛋白。 (3)用純化的蛋白進行酶動力學研究： 1)檢測Lyp不同突變對小分子底物pNPP磷酸酶活力。 2)檢測Lyp不同突變對含有磷酸化酪氨酸的9個氨基酸短肽pLck394的磷酸酶活力。 3)體外純化Src蛋白,用western blotting檢測Lyp不同突變對其416位點的磷酸酶活力。 4)比較Lyp wild type和R266W在pH值4-8.7時對pNPP的磷酸酶活力。 2.細胞功能 用電轉(zhuǎn)的方法將質(zhì)粒(pcDNA4-Lyp-CD-mycHis-wild type, F201, Q263W266)轉(zhuǎn)染Jurkat T細胞,培養(yǎng)細胞48小時后用培養(yǎng)基(對照)和anti-CD3刺激,用特異性的抗體檢測野生型和各突變對ERK和Lck394磷酸化水平的影響,比較Lyp不同突變T細胞信號轉(zhuǎn)導途徑中磷酸化水平的影響。 [研究結(jié)果] 1.生化特性 (1)質(zhì)粒構(gòu)建成功。 (2)通過Ni2+-NTA柱和CM陽離子交換柱,Lyp wild type, S201F, R263Q和R266W的蛋白純度都可以達到95%以上。 (3)酶動力學研究： 1)對小分子底物pNPP的磷酸酶活力：Kcat/Km值可以反映磷酸酶活力的大小Q263的Kcat/Km值與WT相比,差別沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Lyp的S201F,R266W的Kcat/Km值與野生型相比,分別降低了50%和80%。 2)對含有磷酸化酪氨酸的9個氨基酸短肽pLck394磷酸酶活力：F201,Q263,W266的Kcat/Km值與野生型相比,分別降低了20%,40%和60%。 3)對體外純化Src蛋白的磷酸酶活力：反應5分鐘,Lyp野生型可以使Src蛋白的416位酪氨酸磷酸化水平降低50%。Lyp的F201和Q263分別需要10分鐘和30分鐘使Src蛋白的416位酪氨酸磷酸化水平降低50%。而W266的活力顯著降低,反應30分鐘才能Src蛋白的416位酪氨酸磷酸化水平降低20%。 4)在不同的pH值下測Lyp野生型和W266對小分子底物pNPP的酶活變化,計算出酶限速反應階段的解離常數(shù)pKb (wild type R266=6.54, W266=6.01)。 2.細胞功能 野生型Lyp和三個突變能不同程度的影響T細胞內(nèi)Lck和ERK的水平。抑制T細胞的能力：wild type) F201Q263 W266。 [結(jié)論] F201降低了Lyp磷酸酶活力,但對Lyp在T細胞信號轉(zhuǎn)導中的作用基本無影響,而Q263、W266相比野生型的磷酸酶活力明顯減弱,明顯減弱了其對T淋巴細胞的免疫響應的抑制作用,因此稱之為功能缺陷型突變。Q263由于功能缺失可以降低自身免疫性疾病的患病率,W266也可能降低某些自身免疫性疾病的患病率。抑制Lyp的磷酸酶活力可以作為治療自身免疫性疾病的有效方法。
[Abstract]:Lyp is composed of 807 amino acids . Lyp consists of 807 amino acids , including the catalytic domain of 300 amino acids and the regulatory region about 500 amino acids in C terminal . It was found that R263Q could reduce the prevalence of SLE , RA and ulcerative colitis ( UC ) , but also increased the susceptibility of SLE , RA and ulcerative colitis ( UC ) .
These results suggest that Lyp ' s S201F mutation alters the catalytic activity of Lyp in T cell signaling pathway and immune response , but it has little effect on the activity of Lyp in T cells . The R263Q and R266W mutations of Lyp significantly reduce the activity of Lyp on T cell immune response . These results suggest that R263Q can reduce the risk of autoimmune diseases , and R266W gene polymorphism may also affect the susceptibility of autoimmune diseases by affecting the function of Lyp .

Purpose of research

The biochemical characteristics and cellular functions of the different mutations ( S201F , R263Q and R266W ) of lymphoid tissue specific tyrosine phosphatase ( Lyp ) were studied .

Methodology of research

1 . Biochemical characteristics

( 1 ) The primers were designed using the PrimerX software , and the plasmids of Lyp with different mutations were constructed by using the method of QuikChange in the form of PET - 16b - Lyp - CD - His - wild type : 3201F , R263Q , R266W .

( 2 ) The protein ( wild type , S201F , R263Q , R266W ) in the Lyp catalytic region was overexpressed in BL21 . coli , and purified by a Ni 2 + - nta column and a CM cation exchange column to obtain a high purity protein that can be subjected to biochemical analysis .

( 3 ) carrying out the enzymatic kinetics study with purified protein :

1 ) The pNPP phosphatase activity of the small molecule substrate was detected by detecting the different mutation of Lyp .

2 ) The phosphatase activity of 9 amino acid short peptide pLck394 containing phosphorylated tyrosine was detected by Lyp mutation .

The phosphatase activity of different mutation of Lyp was detected by western blotting .

4 ) The phosphatase activity of Lyp wild type and R266W at pH 4 - 8.7 was compared .

2 . Cell function

The effects of wild type and mutation on the phosphorylation of ERK and Lck394 were detected by using specific antibody to detect the phosphorylation of ERK and Lck394 from wild type and mutation , and the effect of Lyp on phosphorylation level in T cell signal transduction pathway was compared .

Outcome of the study

1 . Biochemical characteristics

( 1 ) Plasmid construction was successful .

( 2 ) The purity of the protein of Lyp wild type , S201F , R263Q and R266W can reach more than 95 % through Ni 2 + - nta column and CM cation exchange column .

( 3 ) Enzyme kinetics study :

1 ) The phosphatase activity of pNPP of small molecule substrate : Kcat / Km value can reflect the Kcat / Km value of phosphatase activity Q263 . Compared with WT , the difference is not significant ( P0.05 ) . The Kcat / Km value of Lyp is reduced by 50 % and 80 % compared with wild type .

2 ) The Kcat / Km values of 9 amino acid short peptides containing phosphorylated tyrosine were reduced by 20 % , 40 % and 60 % , respectively , compared with wild type in the Kcat / Km values of F201 , Q263 , W266 .

3 ) The phosphatase activity of the src protein was purified in vitro : reaction for 5 minutes , Lyp wild - type could decrease the tyrosine phosphorylation level of 416 - position tyrosine phosphorylation by 50 % . Lyp ' s F201 and Q263 required 10 minutes and 30 minutes to lower the tyrosine phosphorylation level of 416 - position tyrosine phosphorylation by 50 % . However , the activity of W266 decreased significantly , and the tyrosine phosphorylation level of 416 - position tyrosine phosphorylation decreased by 20 % in 30 minutes .

4 ) Under different pH values , Lyp wild type and W266 were tested for the enzyme activity of pNPP , and the dissociation constant pKb ( wild type R266 = 6.54 , W266 = 6.01 ) was calculated .

2 . Cell function

The wild type Lyp and the three mutations can affect the levels of Lck and ERK in T cells in varying degrees . The ability to inhibit T cells : wild type F201 Q263 W266 .

Conclusion

F201 reduced the activity of Lyp phosphatase , but had no effect on the role of Lyp in T cell signal transduction , but the activity of Q263 , W266 was obviously weakened compared with wild type phosphatase , thus it was called the function defect type mutation . Since function deletion could reduce the prevalence of autoimmune diseases , W266 could reduce the prevalence of autoimmune diseases .

【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R341

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本文編號：1851012