本文選題：EV71 + 上海流行株��； 參考：《復(fù)旦大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：導(dǎo)致嬰幼兒手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)的病原體主要是腸道病毒71型(Enterovirus type71, EV71)和柯薩奇病毒A組16(Coxsackievirus A16, Cox A16)。EV71引起的手足口病,部分患者出現(xiàn)無(wú)菌性腦膜炎(asepicmeningitis)、腦炎(encephalitis)和類脊髓灰質(zhì)炎的麻痹性疾病(poliomyelitis-like paralysis)等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病,甚至死亡 EV71屬小RNA病毒科腸道病毒屬成員之一,其基因組為約7.4kb的單股正鏈RNA,兩端分別為5’非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)和3’UTR,僅含一個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF),編碼約2194個(gè)氨基酸的多聚蛋白(polyprotein),可進(jìn)一步被水解成P1、P2、P3三種前體蛋白。P1進(jìn)一步裂解成4種病毒外殼蛋白VP1-VP4；P2和P3分別裂解成7種非結(jié)構(gòu)蛋白(2A、2B、2C和3A、3B、3C、3D)。 利用上海手足口病患兒糞便標(biāo)本,本研究分離出7株EV71病毒,其中4株來(lái)源于重癥患者,3株來(lái)源于非重癥患者。RT-PCR和3'-RACE將此7株EV71的基因組分為相互重疊的6個(gè)特異性片段進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序,獲得了全基因組序列(GenBank登陸號(hào)碼為HQ891923、HQ891924、HQ891925、HQ891926、HQ891927、HQ891928、HQ891929)。同源性比較及遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),上海流行株與中國(guó)大陸其他地方大部分流行株相似,均屬于C4亞型。VP1進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)EV71上海流行株與北京、阜陽(yáng)、廣東分離株親緣關(guān)系密切。全基因組進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)上海流行性株與阜陽(yáng)、北京和浙江分離株親緣關(guān)系密切,與以VP1所建進(jìn)化樹有細(xì)微差異。將分離的EV71上海流行株與其他基因亞型及Cox A16基因組用Simplot基因相似度和重組分析發(fā)現(xiàn),EV71C4亞型從5’UTR到2A區(qū)域(約3600bp位置)可能源于EV71C2亞型；3C區(qū)域(從5800bp開(kāi)始)到3’UTR可能源于Cox A16,表明EV71C4亞型可能是EV71C2亞型及Cox A16重組形成。 將7株EV71上海流行株感染人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(human rhabdomyosarcomacells,RD),通過(guò)檢測(cè)病毒的TCIDs0及病毒基因組拷貝數(shù),發(fā)現(xiàn)臨床上屬于重癥病例的HQ891923(27號(hào))、HQ891924(28號(hào))、HQ891925(36號(hào))、HQ891928(117號(hào)),只有HQ891923病毒無(wú)明顯復(fù)制及CPE出現(xiàn)。而在臨床上屬于非重癥病例的HQ891926(51號(hào))、HQ891927(64號(hào))、HQ891929(118號(hào))中,HQ891926和HQ891927病毒在RD細(xì)胞上復(fù)制效率很高,CPE明顯且出現(xiàn)較早。因此,上海流行株感染細(xì)胞后表現(xiàn)出來(lái)的復(fù)制及其誘導(dǎo)細(xì)胞CPE的能力,與臨床癥狀沒(méi)有直接相關(guān)性。 由于所分離的上海流行株間的基因組序列差異不明顯,但其復(fù)制能力和致細(xì)胞病變能力差異較大,為進(jìn)一步研究影響病毒基因組復(fù)制控制元件和主要毒力因子,選擇高復(fù)制能力的HQ891927分離株進(jìn)行感染性克隆的構(gòu)建,將全基因組分3段克隆到載體中,并于3'UTR后加上多聚A尾。重組載體經(jīng)過(guò)線性化后,利用噬菌體T7啟動(dòng)子聚合酶系統(tǒng)起始合成RNA轉(zhuǎn)錄本并轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞出現(xiàn)病變反應(yīng),通過(guò)RT-PCR和間接免疫熒光反應(yīng)檢測(cè)到拯救病毒的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)。HQ891927感染性克隆的構(gòu)建成功,為進(jìn)一步研究EV71基因組結(jié)構(gòu)和功能研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:The pathogens that cause hand (foot and mouth disease, HFMD) are mainly the enterovirus 71 (Enterovirus type71, EV71) and the coxsackievirus A group 16 (Coxsackievirus A16), which are caused by hand foot and mouth disease. A variety of nervous system related diseases, such as poliomyelitis-like paralysis, and even death.
EV71 is one of the members of the enteroviruses of the small RNA family, whose genome is about 7.4kb of single strand RNA. The two ends are 5 'non coding region (untranslated region, UTR) and 3' UTR, containing only one open reading frame (open reading frame, ORF), and about 2194 amino acids. The three precursor protein.P1 was further cleavaged into 4 viral coat proteins VP1-VP4, P2 and P3 respectively cleaved into 7 non structural proteins (2A, 2B, 2C and 3A, 3B, 3C, 3D).
7 EV71 viruses were isolated from the stool specimens of children with hand foot and mouth disease in Shanghai. 4 of them were from severe patients. 3 of them were derived from non severe patients.RT-PCR and 3'-RACE. The genome of 7 EV71 strains were divided into 6 specific fragments of each other to be amplified and sequenced, and the whole genome sequence (GenBank landing number was HQ891923). HQ891924, HQ891925, HQ891926, HQ891927, HQ891928, HQ891929). Homology comparison and genetic evolution analysis found that Shanghai epidemic strains are similar to most popular strains in other parts of mainland China, all belong to the C4 subtype.VP1 evolution tree analysis found that EV71 Shanghai epidemic strains are closely related to Beijing, Fuyang and Guangdong isolates. Whole genome evolution tree. The analysis found that Shanghai epidemic strains were closely related to the isolates of Fuyang, Beijing and Zhejiang, and had slight differences with the evolutionary trees built by VP1. The similarity and recombination analysis of the isolated EV71 Shanghai strains and other gene subtypes and the Cox A16 genome by Simplot gene found that the EV71C4 subtype from 5 'UTR to 2A region (about 3600bp position) may be possible. From the EV71C2 subtype, the 3C region (from 5800bp) to 3 'UTR can be derived from Cox A16, suggesting that EV71C4 subtypes may be EV71C2 subtypes and Cox A16 recombination.
7 strains of EV71 Shanghai strain infected human rhabdomyosarcoma cells (human rhabdomyosarcomacells, RD). By detecting the virus TCIDs0 and the copy number of the virus genome, it was found that HQ891923 (No. 27), HQ891924 (28), HQ891925 (36), HQ891928 (117), and only HQ891923 virus did not have obvious replication and CPE appeared. In HQ891926 (No. 51), HQ891927 (No. 64) and HQ891929 (118), the replication efficiency of HQ891926 and HQ891927 virus is very high in RD cells, and the CPE is obvious and appears earlier. Therefore, the replication of the infected cells in Shanghai and the ability to induce cell CPE are not directly related to the clinical symptoms.
The diversity of the genome sequences of the isolated Shanghai epidemic strains is not obvious, but their replication ability and cytopathic ability differ greatly. In order to further study the control elements and major virulence factors affecting the replication of the virus genome, the HQ891927 isolates with high replication ability are selected to construct the infectious clones, and the whole genome is divided into 3 segments. It was cloned into the carrier and added to the A tail after 3'UTR. The recombinant vector was linearized and the phage T7 promoter polymerase system was used to begin to synthesize the RNA transcript and transfect the RD cells. The transfected cells showed the lesion reaction. The genes and proteins that saved the virus were detected by RT-PCR and indirect immunofluorescence. The.HQ891927 sense of the gene and protein was detected. The successful construction of the dye clone laid the foundation for further research on the structure and function of EV71 genome.

【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R373;R3416

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