發(fā)布時間：2018-04-21 05:58

  本文選題：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF) + 條件性味覺厭惡(CTA)��； 參考：《山東大學》2012年博士論文

【摘要】：背景： 信息的儲存、處理和再現(xiàn)是人類賴以生存的重要技能。近些年,人們對認知過程的分子細胞學機制理解有了很大進展,為治療記憶類疾病和緩解人類衰老導致的認知能力降低提供了新靶點、新思路。通過動物模型研究學習記憶的分子機制發(fā)現(xiàn)了參與此過程的一系列分子,其中的一個重要分子就是腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor, BDNF)。 BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)素家族的成員之一,廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng),并在其發(fā)育過程中起到維持和調(diào)控神經(jīng)元存活、分化以及突起生長的重要作用。研究表明,BDNF除了在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育這一特定時期具有重要的營養(yǎng)作用外,還通過其高親和力酪氨酸激酶受體B (TrkB)參與長時程增強(Long term potentiation, LTP)的誘導、維持以及突觸結(jié)構(gòu)修飾等突觸可塑性變化,并且參與多種學習記憶的過程,如Morris水迷宮、放射迷宮、場景性恐懼條件記憶和被動回避學習后,海馬中BDNF mRNA的表達快速升高,提示BDNF的基因轉(zhuǎn)錄與學習記憶過程密切相關。而作為一種分泌蛋白,BDNF必須從神經(jīng)元內(nèi)釋放出來與其受體結(jié)合才能發(fā)揮其生物學功能。研究表明,BDNF第66位的氨基酸殘基由Val突變?yōu)镸et后BDNF調(diào)節(jié)性分泌降低,流行病學調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)此種基因變異與記憶力降低、抑郁癥、早老性癡呆、雙相情感障礙等疾病有關。但目前還沒有直接證據(jù)證實神經(jīng)元活性依賴的BDNF可調(diào)節(jié)性分泌在學習記憶不同過程中的作用。而且以往BDNF調(diào)控學習記憶中的研究都是集中在單獨的腦區(qū)內(nèi)進行,大腦結(jié)構(gòu)的復雜性在于腦內(nèi)不同的核團間有千絲萬縷的纖維聯(lián)系,形成許多神經(jīng)環(huán)路,很少看到在神經(jīng)環(huán)路水平研究BDNF調(diào)節(jié)學習記憶的論文。 條件性味覺厭惡(conditioned taste aversion, CTA)是一種經(jīng)典的條件反射,具體表現(xiàn)為動物在攝取某種具有新異味覺的食物(條件刺激,conditioned stimulus (CS))后,伴隨有后續(xù)的內(nèi)臟不適(如惡心、嘔吐、腹瀉等,非條件刺激,unconditioned stimulus (US)),動物便可較長時間“記住”這種食物的特殊味覺特征,今后將減少或拒絕攝取相同味覺特征食物的過程,可以用來研究記憶的不同過程,如獲得(acquisition)、整合(consolidation)、再現(xiàn)(retrieval)、消退(extinction)等。最重要的是CTA記憶的神經(jīng)環(huán)路較為清楚,神經(jīng)解剖學的研究發(fā)現(xiàn),傳遞味覺和內(nèi)臟感覺的神經(jīng)纖維在島葉(Insular cortex,IC)、杏仁體基底外側(cè)核(basal lateral nuclei of amygdala, BLA)、杏仁體中央核(central nuclei of amygdala, CeA)、丘腦、臂旁核及孤束核等部位交匯,提示以上腦區(qū)可能是CTA記憶的關鍵腦區(qū),腦區(qū)定向毀損及藥理學干預等研究也對此進行了證實。 本課題定位于多個與CTA形成和消退相關腦區(qū),采用動物行為學,腦內(nèi)埋管給藥,Real-time PCR、IP、western-blot等分子生物學研究方法,系統(tǒng)的研究CTA記憶形成過程中活性依賴的BDNF分泌及合成在特定腦區(qū)的特異性調(diào)節(jié)作用以及記憶消退的神經(jīng)環(huán)路機制。通過本課題的研究,能使我們進一步了解BDNF/TrkB參與CTA記憶的神經(jīng)生物學機制,更可為將來以BDNF/TrkB為目標的CTA記憶干預提供新思路和新方法。 目的： 1.探討腦區(qū)特異性BDNF分泌及合成在CTA記憶形成中的作用。 2.探討B(tài)DNF信號調(diào)節(jié)CTA記憶消退的神經(jīng)環(huán)路機制。 方法： 1.條件性味覺厭惡(conditioned taste aversion, CTA)記憶形成和消退 CTA記憶形成：可分為三個階段：適應期、訓練期和測試期。具體過程如下：適應期3天,每天在固定時間給予自來水,使動物養(yǎng)成在固定時間飲水的習慣。訓練期,即第4天時將自來水換成糖水,并在大鼠飲糖水40分鐘后腹腔注射LiCl制造動物腹部不適,建立條件刺激(糖水)和非條件刺激(腹部不適)間的耦聯(lián)。測試期,即訓練期后4h或72h(分別檢測短時記憶和長時記憶),同時給予糖水和自來水,計算動物飲自來水量占飲液體總量的百分比作為厭惡指數(shù)。厭惡指數(shù)越高,說明CTA記憶形成得越好。 CTA記憶消退：即在測試期開始后每天都給予動物糖水和自來水,但不給LiCl注射,連續(xù)6天,每天計算厭惡指數(shù),會發(fā)現(xiàn)動物的厭惡指數(shù)逐漸降低,說明經(jīng)過消退訓練后動物逐漸“忘卻”了這種厭惡記憶。 2. Real-time PCR 在CTA記憶形成和消退的特定時間點,將大鼠斷頭取腦,迅速分離所需腦組織提取RNA并測濃度,同時用凝膠電泳及分光光度計的OD260/280比值判斷RNA質(zhì)量,將質(zhì)量合格的RNA做反轉(zhuǎn)錄,最后做實時定量PCR檢測內(nèi)參actin及目的基因,并用2-△△CT方法統(tǒng)計目的基因的變化情況。 3.原位雜交 大鼠訓練完畢后灌流取腦,于蔗糖中沉淀3天,冰凍切片機切片厚度為40um,每個腦區(qū)取6套組織切片,經(jīng)透化、洗滌、預雜交、雜交、顯色反應,最后用Image J軟件統(tǒng)計各腦區(qū)灰度值,各腦區(qū)的實際灰度值=該腦區(qū)的灰度值-同一切片中未雜交的背景灰度值,如胼胝體。 4.免疫沉淀 在CTA記憶形成的特定時間點,將大鼠斷頭取腦,迅速分離所需腦組織提取蛋白并測濃度,按5mg計算每個樣品的體積,并加入protein A beads潤洗離心后,在上清中加入兔抗TrkB抗體(Millipore,1:100)搖3h,按20：1的比例加protein A beads,4°搖過夜,離心并洗滌完畢后將蛋白變性,待電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉完畢后,分別加入抗磷酸化酪氨酸抗體pY99(Santa Cruz, Califonia,1:4000)及小鼠抗TrkB抗體(BD,1：1000)檢測磷酸化TrkB及總TrkB。其中對照組磷酸化TrkB與總TrkB的灰度比值設為1,其余各組磷酸化TrkB與總TrkB的比值根據(jù)對照組的灰度比值標準化后與其比較。 5.腦內(nèi)埋管藥物干預 將雄性Wistar大鼠(250-280g)麻醉后固定于腦立體定位儀,以前囟點為原點,根據(jù)不同的坐標雙側(cè)腦內(nèi)埋管至特定腦區(qū)。手術恢復一周后開始行為學實驗。根據(jù)不同的研究目的選擇在不同的時間點微量注射藥物,觀察動物行為學有無缺陷。 6.免疫組化 大鼠注射BDNF90分鐘后,灌流取腦,冰凍切片40um,每個腦區(qū)取6套組織切片,經(jīng)10%山羊血清封閉2小時后,加入c-fos (Santa Cruz,1:750)及Neun (Millipore,1:500)的一抗,4度孵育過夜后,分別用488和594標記的二抗室溫孵育1小時。并對實驗組和對照組c-fos表達陽性的神經(jīng)元占總神經(jīng)元的百分比進行比較。 結(jié)果： 1.腦區(qū)特異性BDNF分泌及合成在CTA記憶形成中的研究 1.1CTA記憶形成誘導時空特異性BDNF表達變化 CTA訓練后特定時間點快速取腦切片分離出特定腦區(qū),用Real-time PCR和Elisa檢測BDNFmRNA、BDNF同家族成員神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)和神經(jīng)營養(yǎng)素-4(NT-4)的mRNA及BDNF蛋白的表達變化。我們發(fā)現(xiàn)CTA訓練后,CeA和IC中的BDNFmRNA及蛋白出現(xiàn)了不同程度的升高,而且BDNF蛋白水平升高稍落后于mRNA的變化,其他腦區(qū)如BLA、vmPFC和HIP中BDNF的表達水平在CTA訓練后沒有變化；而且這種表達變化是BDNF特異性的,NGF和NT-4mRNA的表達水平在CTA訓練后沒有變化。為了確認取材部位的準確性,我們進一步通過原位雜交對Real-timePCR的結(jié)果加以驗證。另外,為了確認BDNF的表達變化是CTA條件性學習誘導的,我們設立了不同的行為學對照,以觀察BDNF的表達變化是否是CTA學習記憶誘導的,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BDNF的“時空”表達變化是由于CTA訓練過程中CS和US的耦聯(lián)學習誘導的,并不是CS或US單獨的作用。 1.2CTA記憶形成誘導特定腦區(qū)BDNF的釋放 BDNF需要從神經(jīng)元胞內(nèi)釋放出來后與TrkB受體結(jié)合,誘導TrkB受體磷酸化并激活下游一系列信號,才能發(fā)揮相應的生物學功能。在CTA訓練后我們通過TrkB免疫沉淀結(jié)合pY99Western blot的方法檢測TrkB的磷酸化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTA訓練后1小時(BDNF mRNA和蛋白水平都沒有增加)CeA和IC中的TrkB磷酸化水平已經(jīng)明顯升高并維持到CTA訓練后8小時(BDNF蛋白水平增加達到高峰)。在BLA和vmPFC腦區(qū),TrkB磷酸化水平?jīng)]有變化。這些結(jié)果提示在CTA記憶形成過程中,TrkB磷酸化升高的區(qū)域特異性與BDNF表達變化的區(qū)域特異性一致,但是TrkB磷酸化增加早于BDNF合成增加,說明CTA記憶形成過程首先誘導的是BDNF的分泌釋放,然后出現(xiàn)BDNF合成增加。 1.3CeA中BDNF分泌與合成增加在CTA記憶形成中的作用 為了進一步探討不同腦區(qū)BDNF在CTA記憶形成中的作用,我們首先用腦內(nèi)埋管微量注射Trk受體抑制劑K252a的方法,發(fā)現(xiàn)CeA和IC中抑制Trk受體磷酸化后,CTA短時記憶(short term memory, STM)及長時記憶(long term memory, LTM)均受到不同程度的損傷。為了更特意的研究BDNF分泌及合成增加在CTA記憶形成中的作用,我們在CeA核團內(nèi)埋管分別注射BDNF反義寡聚核苷酸(antisense oligonucleotide, ASO)或BDNF抗體。我們發(fā)現(xiàn)注射BDNF ASO阻斷了CTA訓練后BDNFmRNA的表達增加和訓練后8小時時間點TrkB磷酸化水平的升高,但卻不影響CTA訓練后1小時時間點TrkB磷酸化的增加,提示BDNF ASO注射可以阻斷BDNF表達增加,但卻不影響B(tài)DNF的分泌。另一方面,在CeA注射BDNF抗體后1小時和8小時時間點TrkB磷酸化的增加都被阻斷了,提示注射BDNF抗體可以中和分泌的BDNF,阻止BDNF和TrkB結(jié)合,從而阻斷BDNF的生物學作用。 行為學結(jié)果發(fā)現(xiàn),CeA中注射BDNF ASO不影響CTA STM,但損害CTALTM；而BDNF抗體注射同時干擾了CTA的短時和長時記憶。這解釋了目前文獻關于BDNF參與調(diào)控記憶獲得和整合過程中矛盾的報道。我們進一步的實驗在CTA訓練后1小時再在CeA中注射BDNF抗體,發(fā)現(xiàn)不影響短時記憶,卻干擾了長時記憶的形成,這進一步證實CeA中BDNF分泌參與記憶獲得,而BDNF合成參與了記憶的整合。另一個有意思的現(xiàn)象是,CeA中注射BDNF抗體后也阻斷了CTA訓練誘導的BDNFmRNA合成增加,提示分泌的BDNF激活TrkB受體后能誘發(fā)一個“正反饋”的信號通路刺激BDNF合成增加。 1.4CeA內(nèi)注射重組BDNF能夠增強CTA記憶 我們發(fā)現(xiàn)在CTA訓練過程中給予一個較弱的非條件刺激后導致形成的記憶減弱,伴隨著TrkB磷酸化和BDNF合成降低；在這種弱訓練后CeA內(nèi)注射重組BDNF能夠增強TrkB的磷酸化和強化CTA記憶形成。 2. BDNF信號調(diào)節(jié)CTA記憶消退的神經(jīng)環(huán)路機制 2.1CTA記憶消退誘導特定腦區(qū)BDNF表達變化 CTA消退訓練的第二天測試完畢后不同時間點取腦,用Real-time PCR和Elisa檢測BDNF mRNA、NT-4mRNA及BDNF蛋白水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BLA和IL中的BDNFmRNA及蛋白出現(xiàn)了不同程度的升高,并且BDNF蛋白的增加要晚于mRNA的變化。另外,我們還發(fā)現(xiàn)這種表達變化是BDNF特異性的,BDNF的家族成員NT-4的表達水平在CTA消退訓練后沒有變化。我們進一步通過原位雜交的方法驗證了Real-time PCR的結(jié)果。這些結(jié)果提示CTA記憶消退過程中各關鍵腦區(qū)內(nèi)BDNF表達也有其“時空”變化規(guī)律,并且與記憶獲得過程中的變化規(guī)律有所不同。 2.2IL及BLA中BDNF參與CTA記憶消退 為了進一步研究不同腦區(qū)BDNF在CTA消退中的作用,我們首先用腦內(nèi)埋管微量注射K252a阻斷Trk受體的方法,發(fā)現(xiàn)IL及BLA中注射K252a后與溶劑對照組相比CTA消退明顯延遲。為了更特意性的研究BDNF的作用,我們選擇在IL及BLA注射BDNF抗體,結(jié)果同上。提示IL及BLA中的BDNF在CTA消退過程中起著重要作用。另外,我們還發(fā)現(xiàn)在BLA中注射BDNF抗體后1.5小時取腦,Real-time PCR結(jié)果顯示IL中BDNF表達不再增加,說明BDNF可能通過BLA-IL的神經(jīng)環(huán)路參與CTA記憶消退。我們發(fā)現(xiàn)在CTA消退訓練過程中在IL或BLA注射重組BDNF能夠促進CTA記憶消退。 2.3IL中注射BDNF抗體能夠阻斷BLA注射重組BDNF導致的快速消退 大腦結(jié)構(gòu)的復雜性在于腦內(nèi)不同的核團間有千絲萬縷的纖維聯(lián)系,形成許多神經(jīng)環(huán)路,神經(jīng)束路追蹤研究表明BLA與vmPFC之間有密切的纖維聯(lián)系,為了在神經(jīng)環(huán)路的水平上研究BDNF/TrkB通路在CTA記憶消退中的作用,我們首先用免疫組化的方法觀察在IL及BLA中分別注射BDNF后BLA及IL中神經(jīng)元c-fos的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BDNF能夠通過BLA-IL環(huán)路激活神經(jīng)元。為了進一步驗證在CTA消退過程中BDNF作用的神經(jīng)環(huán)路機制,我們將實驗分為3組：在BLA注射BDNF抗體后立即在IL注射BDNF組(IL BDNF+BLA BDNF antibody),在IL注射BDNF加BLA注射溶劑對照組(IL BDNF+BLA Vehicle)和在IL及BLA均注射溶劑對照組(IL Vehicle+BLA Vehicle)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),1L BDNF+BLA Vehicle組加速了CTA消退,而IL BDNF+BLA BDNF antibody組與IL BDNF+BLA Vehicle組相比沒有差異。接下來我們將實驗組分為：在BLA注射BDNF后立即在IL注射BDNF抗體組(BLA BDNF+IL BDNF antibody),在BLA注射BDNF加IL注射溶劑對照組(BLA BDNF+IL Vehicle)和在IL及BLA均注射溶劑對照組(IL Vehicle+BLA Vehicle)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),BLABDNF+IL Vehicle組加速了CTA消退,而在BLA打BDNF的同時在IL注射BDNF antibody則阻斷這種促消退作用。說明,在CTA消退過程中BDNF信號是從BLA傳到IL 結(jié)論： 1.CTA訓練能夠增加IC及CeA中BDNF的分泌和合成,并且BDNF的分泌要早于BDNF的合成,而對BLA及vmPFC中的BDNF表達沒有影響。 2.CeA中活性依賴的BDNF釋放和合成分別參與CTA記憶的獲得和整合過程。 3.在CeA給予重組BDNF能夠加強CTA記憶的形成。 4.CTA消退訓練能夠增加IL及BLA中BDNF的表達,而對于CeA中的BDNF沒有影響。 5.CTA記憶消退過程中BDNF信號是從BLA傳到IL的。 意義： 本課題的研究將使我們進一步明確活性依賴的BDNF分泌及合成在記憶不同過程中的作用；并為在神經(jīng)環(huán)路水平進一步了解BDNF在學習記憶過程中的作用提供重要幫助。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R338.6

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本文編號：1781205