本文選題：NKT + NK　； 參考：《蚌埠醫(yī)學院》2012年碩士論文

【摘要】：目的： 自然殺傷T細胞(Natural killer T cells, NKT細胞)是一類介導先天性免疫和獲得性免疫的免疫細胞，在抗胞內菌的感染中發(fā)揮重要作用，能通過識別APC表面CD1d提呈的糖脂類抗原（脂類抗原為主）而被活化，進而發(fā)揮作用。細菌在體內外多種因素的作用下可發(fā)生細胞壁缺失，變異成為細菌L型，導致含有較多脂質成分的細胞膜外露，因此我們推想，與野生型相比細菌L型是否能更有效的活化NKT細胞？目前國內外已有許多關于活化后的NKT細胞對細菌的非特異性應答和特異性應答的研究，但關于活化后的NKT細胞對細菌L型的應答研究還很少。因此，我們選用一種兼性胞內寄生菌，即產單核細胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes, LM)，用青霉素誘導其成為L型，并通過尾靜脈注射感染C57BL/6小鼠，分別建立野生型和L型感染的動物模型，通過檢測感染小鼠肝臟和脾臟中野生型和L型細菌數（Colony-Forming Units, CFU）觀察小鼠免疫系統(tǒng)對李斯特菌L型和野生型清除能力的差別；使用流式細胞儀檢測LM野生型和L型感染小鼠后不同時間點肝、脾中NKT細胞的活化比例及絕對數，探討細菌L型對NKT細胞的活化與野生型的差別；用酶聯免疫吸附法測量不同模型中IFN-γ和IL-4在血清中的含量，比較LM及其L型感染小鼠后體內細胞因子分泌量的區(qū)別。 方法： 1．用青霉素誘導LM成為L型，調整野生型和L型LM的終濃度為2×105CFU/ml； 2．通過比較幾種分離方法對肝臟淋巴細胞、NKT、NK細胞比例和細胞絕對數的影響，明確不同肝臟淋巴細胞分離法的適用范圍；3．分別用PBS、野生型和L型LM0.2ml尾靜脈注射感染C57BL/6小鼠，建立動物感染模型，每組4只；4．感染后第3天無菌分離肝臟和脾臟，檢測各組肝臟和脾臟中LM野生型和L型的CFU；5．感染后第1、3天分別分離小鼠肝臟和脾臟的淋巴細胞，采用流式細胞儀檢測各組小鼠肝臟和脾臟淋巴細胞中CD3+NK1.1+NKT、CD3+NK1.1+CD4+NKT、CD3-NK1.1+NK細胞的比例及絕對數；6．摘眼球獲取各組小鼠的外周血，采用酶聯免疫吸附法檢測各組小鼠血清中IFN-γ和IL-4的含量。 結果： 1．經過青霉素紙片法誘導獲得L型LM，在L型培養(yǎng)基中形成油煎蛋樣菌落，革蘭染色見部分細菌由革蘭陽性轉變?yōu)楦锾m陰性，呈多形性；細胞壁染色見細胞壁缺失所致菌體內濃染；2．小鼠肝臟淋巴細胞分離方法中，肝臟的預處理會影響淋巴細胞的獲取率，不放血法獲得的總淋巴細胞絕對數、T細胞比例和絕對數最高；摘眼球放血結合體循環(huán)灌流法獲得的總淋巴細胞比例最高；摘眼球放血法獲得的CD3+NK1.1+NKT、CD3-NK1.1+NK細胞比例最高。同時，不同的Percoll分離方法也影響各種淋巴細胞的獲取，非連續(xù)密度梯度法（33%+70%Percoll）獲得的淋巴細胞、T細胞、CD3+NK1.1+NKT、CD3-NK1.1+NK細胞比例均高于33%組； 3．L型感染組小鼠在感染后第3天肝臟和脾臟的L型CFU數均明顯低于野生型感染組； 4．在感染后的第1天和第3天，比較小鼠肝臟淋巴細胞中的CD3+NK1.1+NKT、CD3+NK1.1+CD4+NKT、CD3-NK1.1+NK細胞的比例和絕對數發(fā)現，L型感染組的上述細胞均高于野生型感染組；2個感染組的上述細胞中，除了第1天CD3+NK1.1+CD4+NKT細胞的比例外，其它細胞各項數值均高于未感染組；其中CD3+NK1.1+NKT、CD3-NK1.1+NK細胞的比例和絕對數在第3天較第1天略有下降，野生型和L型感染組CD3+NK1.1+CD4+NKT的絕對數在第1天和第3天均升高，而第3天較第1天下降，但其比例在L型組中第3天升高，野生型組在第1天下降，第3天升高。 5．比較小鼠脾臟內CD3+NK1.1+NKT和CD3-NK1.1+NK細胞比例和絕對數，發(fā)現L型組均高于野生型組，而且2個感染組均高于未感染組，，與肝臟中不同的是這2種細胞的比例和絕對數在第3天均高于第1天。與未感染組相比，2個感染組小鼠脾臟中CD3+NK1.1+CD4+NKT細胞的比例在感染后第1天時升高，第3天較未感染組低，但是其絕對數在第1和第3天均高于未感染組。L型感染組在感染第1天CD3+NK1.1+CD4+NKT細胞比例高于，但是在第3天卻低于野生型組，而細胞絕對數卻均高于野生型組。 6．ELISA檢測感染小鼠外周血分泌的IFN-γ和IL-4的分泌情況，結果顯示隨著感染時間的增加，血清中IFN-γ水平不斷增加，且L型組高于野生型；而隨著感染時間的增加，血清中的IL-4水平先增加后降低，且L型組比野生型組更低。 結論： 1．采用摘眼球放血結合心臟灌流的方法獲得肝臟單個核細胞懸液，然后采用非連續(xù)密度梯度離心法分離淋巴細胞，可獲得較大比例的肝臟淋巴細胞及其亞群。 2．在小鼠的肝臟和脾臟中，感染的李斯特菌L型比野生型更容易被清除。 3．李斯特菌L型能更有效的刺激CD3+NK1.1+NKT、CD3+NK1.1+CD4+NKT、CD3-NK1.1+NK細胞的增殖，這可能是細菌L型更容易被清除的原因之一。 4．肝臟作為固有免疫器官，在抗李斯特菌及其L型感染的非特異性免疫過程中，肝臟中的NKT和NK細胞在感染早期發(fā)揮作用的高峰比在脾臟更早。 5．在抗李斯特菌及其L型感染中，肝臟中活化后的CD3+NK1.1+NKT細胞可能以CD3+NK1.1+CD4+NKT亞群發(fā)揮主要作用，而脾臟中則以CD3+NK1.1+CD4-NKT為主。 6．與李斯特菌野生型相比，L型感染能誘發(fā)機體的免疫系統(tǒng)產生更多的IFN-γ發(fā)揮抗感染作用。
[Abstract]:Purpose :

Natural killer T cells ( NKT cells ) , a kind of immune cells mediating innate immunity and acquired immunity , play an important role in the infection of intracellular bacteria .
The activation ratio and absolute number of NKT cells in liver and spleen of LM wild - type and L - type infected mice were detected by flow cytometry .
The levels of IFN - 緯 and IL - 4 in serum were measured by enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ) , and the difference of cytokine secretion was compared between LM and L - type infected mice .

Method :

1 . using penicillin to induce LM to become L - type , adjusting the final concentration of wild - type and L - type LM to 2 & # xd7 ; 105 CFU / ml ;


2 . The effects of several methods of separation on the ratio of lymphocyte , NKT , NK cells and absolute number of cells were compared .
3 . C57BL / 6 mice were infected with PBS , wild - type and L - type LM0.2 ml tail vein , and animal infection model was established .
4 . The liver and spleen were isolated after infection on Day 3 after infection , and the CFU of LM wild type and L type were detected in the liver and spleen of each group ;
5 . Lymphocytes from mouse liver and spleen were isolated on days 1 and 3 after infection . CD3 + NK1 . 1 + NKT , CD3 + NK1 . 1 + CD4 + NKT , CD3 + NK1 . 1 + NK cells and absolute numbers of CD3 + NK1 . 1 + CD4 + NKT , CD3 + NK1 . 1 + NK cells were detected by flow cytometry .
6 . The contents of IFN - 緯 and IL - 4 in serum of each group were determined by enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ) .

Results :

1 . L - type LM was induced by penicillin paper method . In L - type culture medium , oil - fried egg - like colony was formed , and Gram - positive transformation of Gram - negative bacteria was found to be negative in Gram - negative .
Cell wall staining was found in the presence of cell wall deletion .
2 . In the method of mouse liver lymphocyte separation , the pretreatment of the liver could affect the rate of lymphocyte acquisition , the absolute number of total lymphocytes obtained by the non - bleeding method , the percentage of T cells and the highest absolute number ;
The proportion of total lymphocytes obtained by the method of blood circulation and blood circulation was the highest .
The ratio of CD3 + NK1 . 1 + NKT , CD3 - NK1 . 1 + NK cells was the highest , and the ratio of lymphocytes , T cells , CD3 + NK1 . 1 + NKT , CD3 - NK1 . 1 + NK cells was higher than that of 33 % .


3 . The number of L - shaped CFU in the liver and spleen of the L - type infected group was significantly lower than that in the wild type infection group on the third day after infection .


4 . The proportion and absolute number of CD3 + NK1 . 1 + NKT , CD3 + NK1 . 1 + CD4 + NKT , CD3 + NK1 . 1 + NK cells in the liver lymphocytes of mice were compared with wild type infection group on days 1 and 3 after infection .
Except for CD3 + NK1 . 1 + CD4 + NKT cells in the first day , the numbers of other cells were higher than those in the non - infected group .
The ratio and absolute number of CD3 + NK1 . 1 + NKT , CD3 - NK1 . 1 + NK cells decreased slightly on Day 1 and Day 1 , while the absolute numbers of CD3 + NK1 . 1 + CD4 + NKT in wild type and L - type infection groups increased on Day 1 and Day 3 , while the third day decreased from Day 1 , but the proportion of CD3 + NK1 . 1 + CD4 + NKT increased on Day 3 in the L - type group and the wild - type group decreased on Day 1 and increased on Day 3 .

The percentage and absolute numbers of CD3 + NK1 . 1 + NKT and CD3 - NK1 . 1 + NK cells in spleen of mice were higher than those in the non - infected group . The percentage and absolute numbers of CD3 + NK1 . 1 + CD4 + NKT cells in the spleen of the two infected groups were higher than those in the uninfected group .

6 . ELISA was used to detect the secretion of IFN - 緯 and IL - 4 in peripheral blood of infected mice . The results showed that the level of IFN - 緯 in serum increased with the increase of infection time , and the L - type group was higher than that of wild type ;
However , with the increase of infection time , the level of IL - 4 in serum decreased first , and L - type group was lower than that of wild - type group .

Conclusion :

1 . The mononuclear cell suspension of the liver was obtained by the method of exophthalmos and cardiac perfusion , then lymphocytes were separated by discontinuous density gradient centrifugation , and a large proportion of the liver lymphocytes and their sub - groups were obtained .

2 . In the liver and spleen of the mouse , the type L of the infection is more easily removed than the wild type .

3 . The proliferation of CD3 + NK1 . 1 + NKT , CD3 + NK1 . 1 + CD4 + NKT , CD3 - NK1 . 1 + NK cells could be more effectively stimulated by L - type . This could be one of the reasons for easier removal of bacterial L - type .

4 . As an innate immune organ , the peak ratio of NKT and NK cells in the liver to the early stage of infection was earlier in the early stage of infection than in the spleen .

5 . The CD3 + NK1 . 1 + NKT cells activated in the liver may play a major role in the CD3 + NK1 . 1 + CD4 + NKT sub - group and CD3 + NK1 . 1 + CD4 - NKT in the spleen .

6 . L - type infection can induce more IFN - 緯 to play an anti - infective role in the body ' s immune system than wild - type strain .

【學位授予單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392

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本文編號：1777201