本文選題：間隙連接 + 半通道�。� 參考：《南京大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：Connexin50(Cx50)是晶狀體中最為重要的間隙連接組成蛋白,并且在晶狀體發(fā)育過程中自然斷裂,而以前的研究認(rèn)為晶狀體Connexin的剪切與細(xì)胞死亡和白內(nèi)障形成有關(guān)。數(shù)年之前,本課題組的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞Cx50可以被類似Caspase-3的蛋白酶剪切。在本文研究中,我們采用最新的核磁共振技術(shù),首次在晶狀體內(nèi)鑒定出了兩個(gè)斷裂位點(diǎn)：Glu-368和Asp-379。這兩個(gè)位點(diǎn)位于Cx50的羧基端。根據(jù)之前的研究結(jié)果,Glu-368是Caspase-3所識別的酶切位點(diǎn)；通過計(jì)算機(jī)分析,Asp-379被確認(rèn)為Caspase-1的剪切位點(diǎn)。Caspase-1和Caspase-3的活性只能夠在晶狀體的皮質(zhì)層中被檢測到,而與之相反的是：剪切生成的Cx50片段幾乎都集中于晶狀體核內(nèi)。經(jīng)紫外輻射處理后的年輕晶狀體可以再現(xiàn)年齡較大的晶狀體中出現(xiàn)的Cx50斷裂情形,并且這種斷裂可以被Caspase-1/3的特異性抑制劑所抑制。與全長的Cx50相比,由Caspase剪切而成的Cx50片段所組成的間隙連接通道的活性顯著降低、而半通道的功能則完全喪失。此外,表達(dá)Cx50片段的細(xì)胞在紫外照射后表現(xiàn)出較高的細(xì)胞存活率。以上結(jié)果顯示Cx50斷裂可能是晶狀體纖維細(xì)胞進(jìn)行自我保護(hù)的一種機(jī)制。 在第一章中,我們采用核磁共振的方法在體內(nèi)鑒定出了Connexin50的斷裂位點(diǎn),并且在ExPASy Proteomics Sever數(shù)據(jù)庫中搜尋到了與該斷裂位點(diǎn)所關(guān)聯(lián)的蛋白酶。此外,我們還引入體外酶切的方法來確認(rèn)Cx50是否為Caspase-1和Caspase-3的底物,并且通過構(gòu)建多種Cx50的點(diǎn)突變克隆來驗(yàn)證Glu-368和Asp-379是否為真正的酶切位點(diǎn)。結(jié)果顯示,Cx50不僅是Caspase-3的底物而且可以被Caspase-1切割,位于羧基端的位點(diǎn)Glu-368和Asp-379分別是這兩個(gè)蛋白酶的關(guān)鍵識別位點(diǎn)。 在第二章中,我們首先確定了Caspase-1和Caspase-3在晶狀體不同時(shí)期發(fā)育的表達(dá)區(qū)域以及表達(dá)水平,并且與Cx50斷裂的情形進(jìn)行了對應(yīng)比較,驗(yàn)證了之前關(guān)于Cx50在晶狀體皮質(zhì)層中被剪切的假設(shè)。我們通過引入紫外輻射的技術(shù)手段,在年輕晶狀體組織中再現(xiàn)了Cx50的斷裂,并且用體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)再次驗(yàn)證了斷裂位點(diǎn)存在的真實(shí)性。劃痕染色實(shí)驗(yàn)和液滴刺激實(shí)驗(yàn)揭示了Cx50片段的生物學(xué)功能,即間隙連接活性大幅降低、半通道功能徹底喪失。借助流式細(xì)胞儀和Annexin V染色的技術(shù),我們將Caspase切割所產(chǎn)生的Cx50片段特有的生物功能與細(xì)胞凋亡聯(lián)系在一起,首次揭示了晶狀體Connexin在保護(hù)細(xì)胞,抗氧化方面的積極作用。 在最后一章的研究中,我們將研究對象拓展到了哺乳動(dòng)物。通過體外酶切實(shí)驗(yàn),我們確認(rèn)了Caspase-1同樣可以識別和切割小鼠Cx50,盡管其氨基酸序列上不存在保守的Caspase-1底物序列。為了準(zhǔn)確定位酶切位點(diǎn),我們克隆并且表達(dá)了包含小鼠Cx50全長羧基端或膜內(nèi)環(huán)的GST融合蛋白,通過體外酶切實(shí)驗(yàn),排除了該位點(diǎn)在羧基端的可能性,初步確定小鼠Cx50序列上與Caspase-1相關(guān)的斷裂位點(diǎn)位于膜內(nèi)環(huán)上。 綜上所述,本文通過研究Cx50的斷裂機(jī)制,準(zhǔn)確定位了斷裂位點(diǎn),找到并且證實(shí)了相關(guān)的蛋白酶,揭示了Cx50斷裂的生物學(xué)功能和晶狀體纖維自我保護(hù)的一種全新機(jī)制,為以后對晶狀體疾病的研究提供了新的思路。
[Abstract]:Connexin50 ( Cx50 ) is the most important gap junction constituent protein in the lens , and naturally breaks during the development of the lens . In the past few years , we have found that the chicken Cx50 can be cleaved by the protease like Caspase - 3 . In this study , we have identified two cleavage sites : Glu - 368 and Asp - 379 in the lens for the first time . According to the previous study , Glu - 368 is the cleavage site recognized by Caspase - 3 .
By computer analysis , Asp - 379 was identified as the cleavage site of Caspase - 1 . The activity of Caspase - 1 and Caspase - 3 could only be detected in the cortical layer of the lens . In contrast , the Cx50 fragment produced by shearing could be inhibited by the specific inhibitor of Caspase - 1 / 3 .

In chapter 1 , we identified the cleavage site of Connexin50 in vivo by nuclear magnetic resonance method , and searched for the protease associated with the cleavage site in the ExPASY Proteomics Sever database . In addition , we introduced in vitro enzyme digestion method to confirm whether Cx50 is the substrate of Caspase - 1 and Caspase - 3 . The results show that Cx50 is not only the substrate of Caspase - 3 but also can be cleaved by Caspase - 1 , and Glu - 368 and Asp - 379 at the carboxy terminal are the key recognition sites of these two proteases .

In chapter 2 , we first determined the expression region and the expression level of Caspase - 1 and Caspase - 3 during different periods of lens , and compared with Cx50 ' s fracture , we verified the hypothesis that Cx50 was sheared in the lens cortex .

In the last chapter , we extended the research object to mammal . Through in vitro enzyme digestion experiment , we confirmed that Caspase - 1 can also recognize and cut the mouse Cx50 , although there is no conserved Caspase - 1 substrate sequence on its amino acid sequence . In order to locate the cleavage site accurately , we cloned and expressed the possibility of the site at the carboxy terminus by in vitro enzyme digestion experiment , and preliminarily determined that the cleavage site related to Caspase - 1 on the Cx50 sequence of mice is located on the inner ring of the membrane .

In conclusion , by studying the fracture mechanism of Cx50 , we locate the cleavage site accurately , find out and confirm the relevant protease , reveal the biological function of Cx50 cleavage and a new mechanism of lens fiber self - protection , and provide a new idea for the study of lens disease later .

【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R3416

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本文編號：1743704