本文選題：重組FGF23 + SUMO融合��； 參考：《吉林大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：目前，，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)23（FGF23）作為FGFs家族中一個(gè)重要的調(diào)磷因子及某些疾病的病理因子已成為一個(gè)特別有吸引力的治療靶標(biāo)；由于FGF23的C末端71個(gè)氨基酸（即180-251位）可與全長(zhǎng)的FGF23競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FGFR-Klotho復(fù)合物，因此，C-末端拮抗肽用于過(guò)多的FGF23引起的低磷血癥治療具有廣泛的應(yīng)用前景。 為了制備具有生物學(xué)活性的可溶性重組人FGF23（rhFGF23）及其拮抗劑蛋白以滿足其日益增加的藥理應(yīng)用需求，本研究克隆了編碼227個(gè)氨基酸殘基的FGF23和帶有6個(gè)his標(biāo)簽的SUMO（小泛素相關(guān)修飾）兩個(gè)基因序列，并構(gòu)建了4種原核表達(dá)載體： pET3c-FGF23、pET3c SUMO-FGF23、pET22b-FGF23及pET22b-SUMO-FGF23。將構(gòu)建好的四種原核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta（DE3）和BL21（DE3）的宿主菌中，對(duì)FGF23表達(dá)的最佳質(zhì)粒和宿主菌組合進(jìn)行篩選，結(jié)果表明只有pET-SUMO-FGF23的質(zhì)粒和Rosetta（DE3）宿主菌的組合具有rhFGF23蛋白表達(dá)。選取Rosetta （DE3）/pET22b-SUMO-FGF23進(jìn)行目地蛋白進(jìn)行最佳誘導(dǎo)上清條件的篩選，結(jié)果融合蛋白在16℃、0.4mM IPTG誘導(dǎo)19小時(shí)后上清表達(dá)量占菌體總蛋白的28％。菌體上清經(jīng)DEAE離子交換及Ni-NTA親和層析純化、SUMO蛋白酶裂解，Western-blotting分析表明rFGF23能與其抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)；進(jìn)一步經(jīng)MALDI-TOF/TOF分析測(cè)定后的搜庫(kù)結(jié)果表明是FGF23蛋白。高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)純化的rFGF23純度高于90％；SUMO-FGF23~(180-251)/Rosett（aDE3）在30℃、0.4mM IPTG誘導(dǎo)6小時(shí)后，融合蛋白約占菌體上清總蛋白的40％。采用人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞測(cè)定rFGF23的生物學(xué)活性，并利用抗磷酸化ERK1/2（P-ERK1/2）抗體免疫印跡法檢測(cè)純化的rFGF23體外活性。采用商品化的（大腸桿菌表達(dá)）FGF23做對(duì)照，結(jié)果表明SUMO融合法得到的rFGF23引起U251細(xì)胞株ERK1/2的磷酸化水平的比值為141%，而商品化的FGF23比值為116%。后續(xù)的體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也證明了SUMO融合法制備的rFGF23能降低固定磷濃度飼料喂養(yǎng)的正常大鼠血液中的磷濃度，且降磷效果優(yōu)于商品化的FGF23;FGF23~(180-251)的體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)內(nèi)源性的FGF23產(chǎn)生較好的抑制效果。本研究成功的獲得了表達(dá)量和活性均較高的rFGF23及FGF23~(180-251)蛋白。
[Abstract]:At present, fibroblast growth 23 FGF23 has become a particularly attractive therapeutic target as an important phosphorous regulatory factor in the FGFs family and a pathological factor for some diseases.Because 71 amino acids (180-251) of C terminal of FGF23 can compete with the full-length FGF23 to bind FGFR-Klotho complex, C- terminal antagonist peptide can be widely used in the treatment of hypophosphatemia induced by excessive FGF23.In order to prepare soluble recombinant human FGF23 (rhFGF23) with biological activity and its antagonist protein to meet its increasing demand for pharmacological applications,The four prokaryotic expression vectors were transformed into E. coli Rosetta-DE3) and BL21DE3) respectively. The best plasmid and host bacteria combination of FGF23 expression were screened. The results showed that only the plasmid of pET-SUMO-FGF23 and the combination of Rosetta-DE3) had rhFGF23 protein expression.Rosetta DE3 / pET22b-SUMO-FGF23 was selected to screen the optimal supernatant of the target protein. The results showed that the supernatant expression of the fusion protein was 28% of the total bacterial protein after 19 hours of induction with 0.4 mm IPTG at 16 鈩

本文編號(hào)：1737369