本文選題：ABCA1　切入點(diǎn)：介導(dǎo)　出處：《南華大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis, As）相關(guān)心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率正逐年升高，其防治成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重要課題。As的發(fā)病過程十分復(fù)雜，近年來，As是一種炎癥疾病的觀點(diǎn)越來越受研究者所重視，血管壁炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是As發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。載脂蛋白A1（apolipoproteinA-Ⅰ, apoA-Ⅰ）是血漿高密度脂蛋白（high density lipoprotein, HDL）的主要成分，參與體內(nèi)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)（reverse cholesterol transport, RCT），因此具有抗As的作用。近來研究發(fā)現(xiàn)，HDL/apoA-Ⅰ除了參與RCT外，還具有顯著的抗炎效應(yīng)，其機(jī)制研究對(duì)于明確As的慢性炎癥疾病特點(diǎn)及其防治具有重要意義。 三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)是以ATP為能源，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）和磷脂流出并轉(zhuǎn)運(yùn)至貧脂apoA-Ⅰ，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇平衡的一種整合膜蛋白。研究顯示，ABCA1基因敲除（ABCA1-KO）鼠相對(duì)于野生鼠，除了在As斑塊中有更嚴(yán)重的脂質(zhì)蓄積外還存在更多的炎癥細(xì)胞浸潤。而且，敲除或干擾ABCA1基因表達(dá)后HDL/apoA-Ⅰ調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的效應(yīng)明顯消失或降低，提示ABCA1主要介導(dǎo)了HDL/apoA-Ⅰ的抗炎效應(yīng)。前期研究顯示，apoA-Ⅰ/ABCA1的結(jié)合具有類似于配體/受體結(jié)合的高飽和性和親和性。當(dāng)apoA-Ⅰ與ABCA1結(jié)合后可迅速激活巨噬細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)途徑，例如雙面神激酶2（Janus kinase2，JAK2），環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和Rho家族小G蛋白CDC42等�；罨疛AK2通常進(jìn)一步激活信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducers andactivators of transcription，STATs)家族蛋白，而JAK2/STATs信號(hào)途徑是介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，從而調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在巨噬細(xì)胞中，JAK2/STAT3信號(hào)途徑被證實(shí)具有重要的抗炎作用，過表達(dá)STAT3或IL-10均可通過激活STAT3而抑制巨噬細(xì)胞多種炎癥因子的表達(dá)。 生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，ABCA1蛋白質(zhì)胞內(nèi)環(huán)的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（nucleotide-binding domain，NBD）存在2個(gè)STAT3的激活位點(diǎn)YXXQ基序（924-927和1990-1993），提示apoA-Ⅰ與ABCA1結(jié)合后可能迅速激活巨噬細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)途徑。因此，本研究從apoA-Ⅰ/ABCA1特殊的配體/受體結(jié)合功能入手，觀察HDL及其主要成分apoA-Ⅰ對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，探討ABCA1介導(dǎo)apoA-Ⅰ調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的胞內(nèi)信號(hào)途徑及其分子機(jī)制，并在體內(nèi)明確apoA-Ⅰ抗As炎癥激活的效應(yīng)及其作用機(jī)制。 第一部分apoA1對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及調(diào)節(jié)方式 目的：觀察HDL及其不同成分對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響，并觀察apoA-Ⅰ調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用方式。 方法：培養(yǎng)THP-1細(xì)胞株，用160nmol/L的佛波酯（phorbol12-myristate13-acetate，PMA）刺激細(xì)胞12h，使其誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，并以50mg/L的氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，oxLDL）孵育細(xì)胞使其轉(zhuǎn)化為THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞。以HDL（30μg/ml）及其主要成分apoA-Ⅰ（10μg/ml）、載脂蛋白B（apolipoprotein B，apoB）（10μg/ml）、卵磷脂（phosphatidyl-choline,PC）（25μg/ml）和膽固醇（cholesterol, CHO）（50ng/ml）分別預(yù)處理細(xì)胞3h后，用LPS（10ng/ml）處理細(xì)胞6h，采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western blotting)和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）法檢測(cè)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α,TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β, IL-1β）、單核細(xì)胞趨化因子1（monocyte chemotactic factor, MCP-1）、干擾素γ（interferon-γ,IFN-γ）、IL-6和環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2, COX-2）的表達(dá)。提取人外周血單核細(xì)胞并誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，oxLDL（50mg/L）孵育過夜后用apoA-Ⅰ（10μg/ml）和/或LPS （10ng/ml）處理細(xì)胞。構(gòu)建含TNF-α啟動(dòng)子的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（chloramphenicol acetyltransferase, CAT）報(bào)告基因，轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞，采用ELISA法觀察apoA-Ⅰ對(duì)LPS誘導(dǎo)TNF-α轉(zhuǎn)錄活性的影響；采用Western-blotting觀察apoA-Ⅰ對(duì)LPS誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞IkBα磷酸化（p-IkBα）和核內(nèi)p65NF-kB表達(dá)的影響；不同處理因素處理細(xì)胞3h，加入放線菌素D（actinomycin D,Act D）終止轉(zhuǎn)錄，采用定量PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞TNF-α等多種炎癥因子mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：HDL和apoA-Ⅰ預(yù)處理THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞3h后，LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α、IL-1β、MCP-1、IFN-γ和IL-6的表達(dá)明顯減少，COX-2的表達(dá)無明顯變化；HDL的其他成分apoB、PC和CHO對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞炎癥因子表達(dá)無明顯影響。ApoA-Ⅰ預(yù)處理人外周血巨噬細(xì)胞3h后顯著降低LPS誘導(dǎo)的TNF-α的表達(dá)。apoA-Ⅰ并不明顯影響LPS誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的TNF-α啟動(dòng)子活性、p-IkBα和核內(nèi)p65NF-kB表達(dá)的水平。Act D終止轉(zhuǎn)錄后，apoA-Ⅰ預(yù)處理明顯降低不同時(shí)間點(diǎn)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6的mRNA表達(dá)量，提示其促進(jìn)了炎癥因子的mRNA降解。 結(jié)論：①apoA-Ⅰ抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞多種炎癥因子的表達(dá)；②apoA-Ⅰ主要通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)炎癥因子mRNA穩(wěn)定性抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)。 第二部分apoA-Ⅰ抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制 目的：探討apoA-Ⅰ抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制。 方法：培養(yǎng)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型和人外周血巨噬細(xì)胞。以apoA-Ⅰ和/或LPS處理THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞或人外周血巨噬細(xì)胞，采用Western-blotting和/或免疫熒光細(xì)胞化學(xué)等方法檢測(cè)鋅指蛋白36（Tristetraprolin，TTP）、人抗原R（Human antigen R，HuR）、磷酸化JAK2和STATs的表達(dá)。分別使用JAK2/STAT3信號(hào)途徑抑制劑AG490，STAT3、ABCA1和TTP小RNA干擾（siRNA）處理細(xì)胞，以實(shí)時(shí)定量PCR、ELISA等方法分別檢測(cè)巨噬細(xì)胞炎癥因子mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。采用RNA-EMSA法檢測(cè)蛋白質(zhì)是否與TNF-α3`非翻譯區(qū)（3`-untranslated regions，3`-UTR）AU重復(fù)序列（AU-rich elements，ARE）形成蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。 結(jié)果：apoA-Ⅰ明顯上調(diào)LPS刺激下THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞和人外周血巨噬細(xì)胞TTP的表達(dá)，對(duì)HuR的表達(dá)沒有明顯影響；TTP siRNA下調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞TTP的表達(dá)，并明顯抑制apoA-Ⅰ下調(diào)炎癥因子表達(dá)和促進(jìn)炎癥因子mRNA降解的作用。RNA-EMSA結(jié)果顯示，apoA-Ⅰ促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與ARE探針形成復(fù)合物，加入TTP抗體形成supershift帶。ApoA-Ⅰ迅速促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞JAK2和STAT3磷酸化，核內(nèi)STAT3表達(dá)增加，STAT1和STAT6的磷酸化不受影響；AG490和STAT3siRNA抑制JAK2、STAT3磷酸化，并明顯抑制apoA-Ⅰ對(duì)TTP表達(dá)的上調(diào)作用。ABCA1siRNA下調(diào)ABCA1的表達(dá)，并明顯抑制apoA-Ⅰ對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞STAT3磷酸化和TTP表達(dá)的上調(diào)作用，也抑制了apoA-Ⅰ促進(jìn)TNF-α mRNA降解的效應(yīng)。 結(jié)論：①apoA-Ⅰ/ABCA1通過JAK2/STAT3信號(hào)途徑上調(diào)LPS刺激下人巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞TTP的表達(dá)；②apoA-Ⅰ通過TTP促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞炎癥因子mRNA的降解。 第三部分apoA-Ⅰ對(duì)apoE-/-小鼠血管壁炎癥反應(yīng)及As病變的影響及機(jī)制 目的：以apoE基因敲除（apoE-KO）小鼠為研究對(duì)象，觀察過表達(dá)人apoA-Ⅰ對(duì)LPS誘導(dǎo)apoE-KO小鼠動(dòng)脈粥樣硬化（As）病變、血管壁巨噬細(xì)胞浸潤和炎癥因子表達(dá)的影響，并在體內(nèi)探討其相關(guān)分子機(jī)制。 方法：20周齡雄性apoE-KO小鼠以普通飼料飼養(yǎng)，并隨機(jī)分為四組：對(duì)照組、LPS組、LPS+apoAⅠ過表達(dá)組和LPS+GFP過表達(dá)組（每組20只）。其中，對(duì)照組每天皮下注射與實(shí)驗(yàn)組同等劑量的生理鹽水；LPS組每天皮下注射LPS（25μg/只）；LPS+apoAⅠ過表達(dá)組除給予LPS處理外，通過尾靜脈注射2型腺相關(guān)病毒rAAV2-apoAⅠ-GFP（1×1011v.p./只）；LPS+GFP過表達(dá)組除給以LPS處理外，通過尾靜脈注射2型腺相關(guān)病毒rAAV2-GFP（1×1011v.p./只）。4周后處死動(dòng)物，采用肝臟組織熒光檢測(cè)、熒光定量PCR法和Western-blotting法檢測(cè)肝臟中人apoA-Ⅰ mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平；免疫比濁法檢測(cè)血清中人apoA-Ⅰ的表達(dá)水平。采用酶氧化法檢測(cè)甘油三酯、總膽固醇等血脂水平；ELISA法檢測(cè)血清炎癥因子（TNF-α、IL-1β和MCP-1等）的表達(dá)；HE染色法觀察主動(dòng)脈竇動(dòng)脈粥樣硬化病變情況；油紅O染色觀察主動(dòng)脈和主動(dòng)脈竇處脂質(zhì)蓄積情況；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68的表達(dá)；熒光定量PCR和/或Western-blotting法檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈ABCA1、TTP、p-JAK2和p-STAT3mRNA和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)。提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，，檢測(cè)TTP和炎癥因子mRNA的降解情況。 結(jié)果：肝臟組織熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，rAAV2注射后4周仍可檢測(cè)到GFP表達(dá)；熒光定量PCR和Western-blotting法結(jié)果顯示，apoA-Ⅰ過表達(dá)組小鼠肝臟中人apoA-Ⅰ的mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯升高；免疫比濁法顯示apoA-Ⅰ過表達(dá)組小鼠血清中存在人apoA-Ⅰ的表達(dá)，而GFP過表達(dá)組未檢測(cè)到人apoA-Ⅰ。與對(duì)照組比較，LPS組小鼠血漿HDL水平降低，其他脂質(zhì)成分無明顯改變，但TNF-α、IL-1β和MCP-1等炎癥因子的水平明顯升高，主動(dòng)脈竇處As病變面積增大，主動(dòng)脈和主動(dòng)脈竇部脂質(zhì)含量增加，主動(dòng)脈炎癥因子水平明顯升高，主動(dòng)脈竇部炎癥細(xì)胞浸潤明顯；與LPS組小鼠比較，LPS+apoA-Ⅰ過表達(dá)組小鼠的HDL-膽固醇和總膽固醇明顯增加，血漿炎癥因子的水平明顯降低，主動(dòng)脈竇處As病變明顯減輕，主動(dòng)脈和主動(dòng)脈竇部脂質(zhì)含量明顯減少，主動(dòng)脈炎癥因子水平明顯降低，主動(dòng)脈竇部巨噬細(xì)胞浸潤明顯減少，主動(dòng)脈ABCA1、p-JAK2、p-STAT3和TTP的表達(dá)明顯增加。相對(duì)于LPS組，LPS+apoA-Ⅰ過表達(dá)組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TTP的表達(dá)明顯增加，TNF-α和IL-1β的mRNA降解率增快。相對(duì)于LPS組，LPS+GFP過表達(dá)組小鼠上述指標(biāo)無明顯變化。 結(jié)論：①過表達(dá)人apoA-Ⅰ抑制LPS誘導(dǎo)apoE-KO小鼠As病變的發(fā)展；②apoA-Ⅰ降低LPS處理apoE-KO小鼠炎癥因子水平，并抑制斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤；③apoA-Ⅰ上調(diào)apoE-KO小鼠主動(dòng)脈和腹腔巨噬細(xì)胞TTP的表達(dá)，并促進(jìn)炎癥因子mRNA降解，該效應(yīng)與激活JAK2/STAT3途徑和上調(diào)ABCA1有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 甄為;羅俊生;霍曉川;關(guān)寧;王之赫;邱建武;;羧酸酯酶1對(duì)大鼠頸動(dòng)脈損傷后血管狹窄及炎性反應(yīng)的影響[J];解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2014年03期

本文編號(hào)：1726029