本文選題：剛地弓形蟲　切入點：profilin　出處：《吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)》2017年06期

【摘要】：目的:探討剛地弓形蟲肌動蛋白profilin(TgPRF)的原核表達體系和純化條件,為后續(xù)的抗腫瘤免疫佐劑研究提供依據(jù)。方法:以弓形蟲RH株速殖子的cDNA為模板,采用一對特定的引物擴增TgPRF基因的編碼區(qū)。PCR產(chǎn)物雙酶切后克隆入pET28a(+)載體中。重組的pET28a(+)-TgPRF質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞。雙酶切鑒定陽性克隆,并選取測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)表達菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達4 h,SDS-PAGE法檢測TgPRF蛋白的表達,Western blotting法檢測重組蛋白His-prolilin的表達。結(jié)果:PCR擴增產(chǎn)物長度為492bp。經(jīng)雙酶切和測序,重組質(zhì)粒pET28a-TgPRF連接產(chǎn)物構(gòu)建成功。SDSPAGE檢測,目的蛋白在超聲菌液的上清中表達。經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱純化,獲得純化的TgPRF蛋白(純度90%)。Western blotting檢測,重組TgPRF蛋白能被Anti-His抗體識別。結(jié)論:成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-TgPRF,并實現(xiàn)可溶性原核表達。
[Abstract]:Aim: to investigate the prokaryotic expression system and purification conditions of TgPRF of Toxoplasma gondii actin profilinus, and to provide a basis for the further study of antitumor immune adjuvants.Methods: using cDNA of Toxoplasma gondii RH strain tachyzoites as template, the encoding region of TgPRF gene was amplified by a pair of specific primers and cloned into pET28a () vector.The recombinant plasmid pET28a (TgPRF) was transformed into E.coli DH5 偽 competent cells.The positive clones were identified by double enzyme digestion, and the recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21DE3). The expression of TgPRF protein was detected by IPTG induced expression 4 h SDS-PAGE and the expression of recombinant protein His-prolilin was detected by Western blotting method.Results the length of PCR amplification product was 492bp.After double enzyme digestion and sequencing, the recombinant plasmid pET28a-TgPRF ligation product was successfully constructed. SDS-PAGE was used to detect the expression of the protein in the supernatant of ultrasonic bacteria.The purified TgPRF protein was purified by Ni-NTA agarose gel column. The purified TgPRF protein (purity 90%).Western blotting) could be recognized by Anti-His antibody.Conclusion: the recombinant plasmid pET28a-TgPRF was successfully constructed and expressed in soluble prokaryotic expression.
【作者單位】： 吉林大學(xué)第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院移植免疫實驗室;吉林大學(xué)第二醫(yī)院檢驗科;
【基金】：吉林省科技廳自然科學(xué)基金資助課題(20150101127JC)
【分類號】：R382.5

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本文編號：1725575